Przegląd Mleczarski 8/2025 – Potencjał bakterii fermentacji mlekowej w kontroli Listeria monocytogenes w przetwórstwie mleczarskim
Mikrobiologiczne bezpieczeństwo żywności, ze szczególnym uwzględnieniem produktów mleczarskich, stanowi jedno z fundamentalnych zagadnień współczesnej technologii żywności. Istotnym zagrożeniem w tym kontekście pozostaje obecność patogennych mikroorganizmów, w tym Listeria monocytogenes, która budzi istotne obawy zarówno wśród producentów, jak i konsumentów.
Gatunek ten (Listeria monocytogenes) cechuje się wysoką tolerancją na zmienne i niekorzystne warunki środowiskowe, w tym niską temperaturę oraz ograniczoną dostępność składników odżywczych, co sprzyja jego przetrwaniu i namnażaniu w szerokim zakresie matryc żywnościowych, w tym w produktach mleczarskich [8, 22]. Spożycie produktów skażonych L. monocytogenes może prowadzić do wystąpienia listeriozy – ciężkiej choroby zakaźnej o wysokim współczynniku śmiertelności, szczególnie w populacjach wysokiego ryzyka, takich jak kobiety ciężarne, osoby w podeszłym wieku oraz pacjenci z obniżoną odpornością [65].W obliczu rosnącego zapotrzebowania na ograniczenie stosowania chemicznych środków konserwujących, coraz większym zainteresowaniem cieszą się naturalne strategie biokonserwacji. Wśród metod ochrony biologicznej szczególną rolę odgrywają bakterie kwasu mlekowego (LAB, Lactic Acid Bacteria), które wykazują szerokie spektrum aktywności antagonistycznej wobec mikroorganizmów patogennych, w tym Listeria monocytogenes [23]. Ich działanie opiera się na licznych mechanizmach, takich jak synteza metabolitów przeciwdrobnoustrojowych (np. bakteriocyn), zakwaszanie środowiska poprzez produkcję kwasu mlekowego, konkurencja o składniki odżywcze i miejsca adhezji, a także zdolność do tworzenia ochronnych biofilmów [50, 53]. Właściwości te predysponują LAB nie tylko do zastosowań w tradycyjnych procesach fermentacyjnych, lecz również jako środki ochrony mikrobiologicznej produktów świeżych, w tym mleczarskich [11]. Ich implementacja wpisuje się w globalny trend wydłużania trwałości produktów spożywczych, przy jednoczesnym ograniczaniu użycia syntetycznych dodatków konserwujących.
W ostatnich latach obserwuje się intensyfikację badań nad potencjałem bioprotekcyjnym wyselekcjonowanych szczepów LAB, ze szczególnym uwzględnieniem tych, które produkują bakteriocyny aktywne wobec L. monocytogenes. Przykładowo, pediocyny wykazują wysoką skuteczność wobec bakterii Gram-dodatnich, nie wpływając jednocześnie negatywnie na właściwości sensoryczne żywności. Coraz większą uwagę zwraca się również na synergizm pomiędzy różnymi mechanizmami inhibicji, stosowanymi przez LAB, co może znacząco zwiększać skuteczność ochrony mikrobiologicznej, zwłaszcza w warunkach przechowywania niekorzystnych z punktu widzenia jakości mikrobiologicznej [14].
Zastosowanie bakterii fermentacji mlekowej w nowoczesnych strategiach biokonserwacji otwiera nowe perspektywy w zakresie poprawy bezpieczeństwa mikrobiologicznego żywności oraz redukcji strat ponoszonych na etapie produkcji i dystrybucji. W związku z powyższym zasadne jest kontynuowanie badań ukierunkowanych na identyfikację najbardziej efektywnych szczepów LAB, optymalizację warunków ich aplikacji oraz ocenę ich wpływu na jakość sensoryczną i trwałość produktów spożywczych. Kluczowe pozostaje również pogłębienie wiedzy na temat interakcji pomiędzy wybranymi szczepami bakterii fermentacji mlekowej a patogenami w warunkach rzeczywistych matryc żywnościowych [11].
Występowanie L. monocytogenes w środowisku i żywności
Listeria monocytogenes jest fakultatywnie wewnątrzkomórkowym patogenem Gram-dodatnim, szeroko rozpowszechnionym w środowisku naturalnym. Jej obecność w różnorodnych ekosystemach, takich jak gleba, wody powierzchniowe, ścieki oraz powierzchnie roślinne, wynika z wyjątkowych zdolności adaptacyjnych oraz wysokiej tolerancji na zmienne warunki środowiskowe [37, 42]. Bakteria ta kolonizuje również materiały organiczne, takie jak gnijąca biomasa roślinna i kompost, wykorzystując dostępne substancje odżywcze. Rezerwuarem naturalnym L. monocytogenes są ponadto dzikie i hodowlane zwierzęta, zwłaszcza przeżuwacze, ptaki i ryby, które mogą być wektorami przenoszenia patogenu do środowiska poprzez kał, co sprzyja jego dalszemu rozpowszechnianiu [22, 30].
Obecność L. monocytogenes w środowisku rolniczym, w tym na terenie gospodarstw mleczarskich, stanowi istotne źródło kontaminacji surowców mlecznych. Szczególne zagrożenie mikrobiologiczne stanowi jej zdolność do adhezji i tworzenia biofilmów na powierzchniach technologicznych (m.in. ze stali nierdzewnej i tworzyw sztucznych), co umożliwia przeżycie mikroorganizmu pomimo stosowania standardowych procedur mycia i dezynfekcji w zakładach przetwórstwa spożywczego [8, 44]. Zdolność ta znacząco zwiększa ryzyko zanieczyszczenia produktów gotowych do spożycia, takich jak sery dojrzewające, mleko pasteryzowane, produkty mięsne, ryby wędzone na zimno oraz sałatki typu Ready-To-Eat (RTE) [67].
W obrębie produktów spożywczych L. monocytogenes wykazuje wysoki poziom tolerancji względem warunków przechowywania, w tym niskich temperatur oraz wysokiego stężenia NaCl. Szczególną cechą tego drobnoustroju jest zdolność do wzrostu w temperaturze bliskiej 0°C, co sprawia, że produkty chłodzone o wydłużonym okresie przydatności do spożycia mogą stanowić istotne źródło zakażenia [25]. Przykładami takich produktów są m.in. jogurty, sery pleśniowe, masło, mleko UHT oraz przetwory mleczne przechowywane w opakowaniach próżniowych. Ryzyko obecności patogenu w produktach mleczarskich jest szczególnie wysokie, gdyż mikroorganizm ten może przeżyć łagodne procesy pasteryzacyjne oraz namnażać się podczas długotrwałego przechowywania w warunkach chłodniczych [48, 62].
Zgodnie z najnowszym raportem na temat zoonoz w Unii Europejskiej One Health 2023 Zoonoses Report [20], opracowanym przez Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA) oraz Europejskie Centrum ds. Zapobiegania i Kontroli Chorób (ECDC), w 2023 roku odnotowano rekordową liczbę potwierdzonych przypadków listeriozy – łącznie 2952 infekcje, co stanowi najwyższy wynik od początku prowadzenia systematycznego monitoringu od 2007 roku.
Tendencja wzrostowa wiąże się m.in. ze zmianami demograficznymi w Europie, zwłaszcza ze wzrostem odsetka populacji w podeszłym wieku, wykazującej zwiększoną podatność na ciężki przebieg zakażenia [20].
Wyniki analiz ryzyka mikrobiologicznego wskazują, że produkty mleczne gotowe do spożycia nadal mogą stanowić potencjalne źródło kontaminacji L. monocytogenes. Wykrycie patogenu stwierdzono w 0,47% spośród ponad 22 tysięcy próbek różnych produktów mleczarskich. Niższy poziom kontaminacji zaobserwowano w przypadku serów wytwarzanych z mleka pasteryzowanego (0,26%), natomiast istotnie wyższy – 1,4% – odnotowano w serach wyprodukowanych z mleka surowego lub poddanego jedynie łagodnej obróbce cieplnej. W próbkach surowego mleka nie wykazano obecności patogenu. Najwyższy poziom zanieczyszczenia – sięgający 6,7% – zaobserwowano w wybranych grupach serów wyprodukowanych z mleka niepasteryzowanego, głównie z pięciu państw członkowskich UE: Austrii, Holandii, Rumunii, Słowacji oraz Hiszpanii. Państwa te odpowiadały za zdecydowaną większość danych w tej kategorii. Większość przebadanych próbek pochodziła z mleka krowiego – udział ten wyniósł 92,4% w przypadku mleka i 76,3% w przypadku serów [20].
Normy prawne i limity obecności Listeria monocytogenes w żywności
Międzynarodowe organizacje regulacyjne opracowały szczegółowe przepisy prawne i normy mikrobiologiczne dotyczące obecności Listeria monocytogenes w środkach spożywczych, mające na celu ograniczenie ryzyka zakażenia tym patogenem oraz minimalizację zagrożeń dla zdrowia publicznego. Unia Europejska (UE), Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) oraz Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) ustanowiły dopuszczalne limity obecności tej bakterii w różnych kategoriach żywności, z uwzględnieniem grup konsumenckich szczególnie narażonych na ciężki przebieg infekcji.
W Unii Europejskiej kwestie dotyczące kryteriów mikrobiologicznych dla L. monocytogenes zostały uregulowane w Rozporządzeniu Komisji (WE) nr 2073/2005 z dnia 15 listopada 2005 r. oraz jego nowelizacji (WE) nr 1441/2007 z dnia 5 grudnia 2007 r. Dla wyrobów wytwarzanych z mleka surowego odniesienie stanowi również Dyrektywa Rady 92/46/EWG z dnia 16 czerwca 1992 r. Zgodnie z tymi aktami prawnymi, w przypadku mleka surowego oraz produktów mleczarskich wymaga się całkowitej nieobecności L. monocytogenes w 1 g próbki (0 CFU/g).
Rozporządzenie Komisji (UE) 2024/2895 z dnia 20 listopada 2024 r. zaostrza kryteria bezpieczeństwa mikrobiologicznego dla produktów gotowych do spożycia (Ready-To-Eat, RTE), wprowadzając obowiązek potwierdzenia nieobecności patogenu w liczbie 0 jtk/25 g, w przypadku produktów wspierających jego wzrost. Dla żywności niesprzyjającej namnażaniu bakterii dopuszczalna jest obecność nieprzekraczająca 100 jtk/g przez cały deklarowany okres przydatności do spożycia. Nowelizacja ta precyzuje również kryteria klasyfikacji produktów jako wspierających lub niewspierających wzrost L. monocytogenes, a także ustanawia obowiązek walidacji metod służących ocenie trwałości mikrobiologicznej żywności, co ma zapewnić jednolitą interpretację i stosowanie przepisów w całej UE.
Zgodnie z raportem WHO pt. Risk assessment of Listeria monocytogenes in ready-to-eat foods, poziom tego patogenu w żywności gotowej do spożycia nie powinien przekraczać 100 CFU/g. Jednak w przypadku produktów przeznaczonych dla grup wysokiego ryzyka – w szczególności kobiet w ciąży, noworodków oraz osób w podeszłym wieku – obowiązuje surowszy limit, wynoszący 0 CFU/25 g próbki. WHO podkreśla również konieczność ścisłego przestrzegania warunków chłodniczych (< 4°C) oraz prowadzenia regularnego monitoringu środowiska produkcyjnego, ze szczególnym uwzględnieniem powierzchni kontaktujących się z żywnością [69].
Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA), w ramach FDA Food Code, przyjęła politykę „zerowej tolerancji” wobec L. monocytogenes w produktach gotowych do spożycia. Przepisy te wymagają całkowitej nieobecności patogenu w każdej próbce o masie 25 g (0 CFU/25 g), niezależnie od zdolności produktu do wspierania wzrostu bakterii (FDA, 2019).
W polskim prawodawstwie kwestie te uregulowano w Rozporządzeniu Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi z dnia 18 maja 2005 r. w sprawie mikrobiologicznych kryteriów dla środków spożywczych. Przewiduje ono całkowity zakaz obecności Listeria monocytogenes w mleku oraz produktach mlecznych (0 CFU/g). Dodatkowo, rozporządzenie nakłada obowiązek przetworzenia mleka surowego w ciągu 36 godzin od momentu jego dostarczenia do zakładu, pod warunkiem przechowywania w temperaturze nieprzekraczającej 6°C lub w ciągu 48 godzin, jeśli przechowywanie odbywa się w temperaturze ≤ 4°C [59].
Warunki wzrostu oraz wymagania fizykochemiczne bakterii fermentacji mlekowej
Bakterie fermentacji mlekowej (LAB, ang. Lactic Acid Bacteria) charakteryzują się zróżnicowanymi wymaganiami fizykochemicznymi, jednak w większości preferują umiarkowane warunki środowiskowe. Optymalna temperatura wzrostu dla tych mikroorganizmów mieści się zazwyczaj w przedziale 20-45°C. Gatunki termofilne, takie jak niektóre przedstawiciele rodzajów Streptococcus i Lactobacillus, wykazują największą aktywność wzrostową w zakresie 40-45 °C, podczas gdy mezofile, np. Lactococcus lactis, preferują temperatury w przedziale 30-37°C [3]. Pod względem wymagań tlenowych większość LAB to bakterie mikroaerofilne lub fakultatywnie beztlenowe, zdolne do wzrostu w warunkach ograniczonego dostępu tlenu [46].
Zakres tolerancji pH wśród LAB jest stosunkowo szeroki – wzrost może zachodzić w środowisku o pH od około 4,0 do 9,0. Jednak optymalne warunki do intensywnego namnażania występują zwykle przy pH 5,5-6,5. Bakterie te wykazują również relatywnie wysoką odporność na obecność soli – liczne szczepy są w stanie przetrwać w środowisku zawierającym 6-10% NaCl. Właściwość ta czyni je szczególnie przydatnymi w fermentacji substratów o obniżonej aktywności wody, takich jak sery dojrzewające czy fermentowane warzywa [74].
LAB charakteryzują się specyficznymi wymaganiami odżywczymi, niezbędnymi do prawidłowego wzrostu oraz przebiegu podstawowych procesów metabolicznych. Głównym źródłem energii dla tych mikroorganizmów są węglowodany, zwłaszcza cukry łatwo fermentujące, takie jak glukoza, laktoza i sacharoza, które ulegają fermentacji z wytworzeniem kwasu mlekowego jako głównego metabolitu [26]. Dodatkowo, bakterie te wymagają obecności aminokwasów, które odgrywają istotną rolę zarówno jako prekursory biosyntezy białek, jak i substraty reakcji metabolicznych. Z uwagi na ograniczoną zdolność wielu szczepów LAB do syntezy wszystkich niezbędnych aminokwasów, ich obecność w pożywce hodowlanej jest kluczowa [36].
Witaminy z grupy B stanowią istotny element metabolizmu komórkowego bakterii fermentacji mlekowej, pełniąc funkcję kofaktorów enzymatycznych w szlakach przemian energetycznych oraz biosyntezy kwasów nukleinowych [64]. Chociaż wiele szczepów LAB posiada zdolność syntezy wybranych witamin B – w tym ryboflawiny oraz kwasu foliowego – zapotrzebowanie na te związki może być częściowo redukowane. Niektóre szczepy wykazują również ograniczoną zdolność biosyntezy kobalaminy (wit. B₁₂), jednak proces ten zachodzi zazwyczaj jedynie w obecności specyficznych warunków środowiskowych [35].
Oprócz związków organicznych, bakterie fermentacji mlekowej wymagają dostępu do odpowiednich soli mineralnych. Kationy takie jak Mg²⁺, Mn²⁺ oraz Fe²⁺/Fe³⁺ są niezbędne do aktywacji wielu enzymów oraz utrzymania integralności strukturalnej komórek [29]. Warunki sprzyjające wzrostowi LAB obejmują również dostęp do źródła azotu, najczęściej w postaci peptydów lub wolnych aminokwasów. Obecność związków antybakteryjnych, takich jak nadtlenek wodoru czy niektóre związki fenolowe, może znacząco hamować aktywność metaboliczną bakterii. Dlatego też oprócz optymalnej temperatury i pH, skład chemiczny środowiska wzrostu stanowi kluczowy czynnik determinujący ich aktywność biotechnologiczną [74].
Produkty fermentacji mlekowej
Bakterie fermentacji mlekowej odgrywają kluczową rolę w biokonwersji surowców spożywczych do produktów fermentowanych, stanowiąc istotny element w technologii żywności. Ich głównym metabolitem jest kwas mlekowy, powstający w wyniku fermentacyjnego rozkładu węglowodanów, głównie glukozy. W zależności od szlaku metabolicznego, bakterie te mogą prowadzić fermentację homofermentacyjną, w której glukoza jest niemal całkowicie przekształcana w kwas mlekowy lub fermentację heterofermentacyjną, w wyniku której – oprócz kwasu mlekowego – powstają również inne metabolity, takie jak etanol, dwutlenek węgla czy kwas octowy [54, 73].
W przypadku fermentacji homofermentacyjnej, gatunki takie jak Lactococcus lactis oraz Streptococcus thermophilus charakteryzują się wysoką wydajnością produkcji kwasu mlekowego, co skutkuje szybkim obniżeniem pH środowiska. Zjawisko to prowadzi do zahamowania wzrostu mikroorganizmów niepożądanych i patogennych, co jest szczególnie istotne w kontekście bezpieczeństwa mikrobiologicznego żywności. Mechanizm ten stanowi podstawę technologii produkcji takich wyrobów jak, jogurt, kefir, masło oraz sery dojrzewające [40].
Oprócz zdolności do zakwaszania środowiska, bakterie fermentacji mlekowej wykazują aktywność metaboliczną prowadzącą do biosyntezy licznych związków bioaktywnych. Należą do nich m.in. bakteriocyny – peptydy przeciwdrobnoustrojowe, które wykazują aktywność wobec drobnoustrojów patogennych i mikroflory odpowiedzialnej za psucie żywności, przyczyniając się do zwiększenia trwałości i bezpieczeństwa produktów fermentowanych [26]. Ponadto, niektóre szczepy LAB syntetyzują egzopolisacharydy (EPS), które modyfikują właściwości reologiczne i teksturalne produktów mlecznych, wpływając pozytywnie na ich kremowość, stabilność i lepkość [75]. W wyniku aktywności fermentacyjnej LAB powstają również związki lotne o znaczeniu sensorycznym, takie jak aldehydy, ketony oraz estry, które nadają charakterystyczny aromat i smak fermentowanym produktom spożywczym, w tym serom, fermentowanym napojom mlecznym (np. kefirom) oraz warzywom poddanym fermentacji mlekowej [54].
Znaczenie bakterii fermentacji mlekowej w technologii żywności
Bakterie fermentacji mlekowej stanowią istotny komponent w technologii przetwórstwa żywności, zwłaszcza w kontekście procesów fermentacyjnych. Mikroorganizmy te odgrywają kluczową rolę w kształtowaniu cech sensorycznych, zwiększaniu trwałości mikrobiologicznej oraz podnoszeniu wartości odżywczej produktów spożywczych [39]. Ich aktywność metaboliczna prowadzi do biosyntezy szeregu związków bioaktywnych, takich jak kwas mlekowy, bakteriocyny, diacetyl, nadtlenek wodoru oraz inne kwasy organiczne, które nie tylko determinują profil smakowo-zapachowy produktów fermentowanych, lecz także wykazują działanie przeciwdrobnoustrojowe [28].
LAB znajdują szerokie zastosowanie w fermentacji mleka (np. jogurty, kefiry, sery), mięsa (kiełbasy fermentowane) oraz warzyw (kiszonki). W tych matrycach żywnościowych pełnią funkcję technologicznego czynnika poprawiającego teksturę i właściwości organoleptyczne produktów, a także ograniczają ryzyko zepsucia i skażenia patogenami [73]. Ponadto, wybrane szczepy bakterii fermentacji mlekowej wykazują działanie probiotyczne, przyczyniając się do stabilizacji składu mikrobioty jelitowej, stymulacji odpowiedzi immunologicznej organizmu gospodarza oraz poprawy parametrów metabolicznych [55].
W technologii serowarskiej bakterie fermentacji mlekowej pełnią kluczową rolę w inicjowaniu procesu zakwaszania mleka, co skutkuje denaturacją białek i koagulacją kazeiny – stanowiąc tym samym pierwszy etap formowania struktury skrzepu serowego. W dalszych etapach dojrzewania LAB uczestniczą w proteolizie oraz lipolizie, wpływając na rozwój złożonego profilu aromatyczno-smakowego, charakterystycznego dla poszczególnych typów serów [39].
Aspekty regulacyjne i bezpieczeństwo bakterii fermentacji mlekowej
Bakterie fermentacji mlekowej są szeroko uznawane za mikroorganizmy bezpieczne do zastosowania w przemyśle spożywczym. Potwierdzeniem ich bezpieczeństwa są nadawane przez właściwe instytucje statusy regulacyjne: GRAS (Generally Recognized As Safe), przyznawany przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) oraz QPS (Qualified Presumption of Safety), określany przez Europejski Urząd ds. Bezpieczeństwa Żywności (EFSA). Kryteria te opierają się na obszernych danych naukowych oraz ekspertyzach specjalistycznych komisji [21, 68]. Liczne szczepy należące do rodzajów Lactobacillus, Lactococcus oraz Leuconostoc zostały oficjalnie zaklasyfikowane jako bezpieczne do stosowania w żywności.
W Unii Europejskiej przyznanie statusu QPS eliminuje konieczność prowadzenia pełnej oceny ryzyka mikrobiologicznego dla określonych szczepów wykorzystywanych w przemyśle spożywczym i paszowym. Kluczowe warunki przyznania tego statusu obejmują: brak udokumentowanej patogenności, długą historię bezpiecznego stosowania oraz jednoznaczną klasyfikację taksonomiczną danego mikroorganizmu [21].
Bezpieczeństwo bakterii fermentacji mlekowej wynika zarówno z wieloletniego doświadczenia technologicznego, jak i z ograniczonej zdolności tych organizmów do poziomego transferu genów oporności na antybiotyki oraz niskiego potencjału toksynotwórczego. Niemniej jednak aktualne podejścia badawcze akcentują konieczność prowadzenia dokładnej selekcji szczepów z uwzględnieniem aspektów bezpieczeństwa genetycznego i metabolicznego, szczególnie w kontekście rosnących obaw związanych z opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe [61]. Zastosowanie analiz całogenomowych umożliwia identyfikację genów odpowiedzialnych za niepożądane cechy, co pozwala na eliminację szczepów potencjalnie stwarzających ryzyko dla zdrowia publicznego.
Oprócz potwierdzonego profilu bezpieczeństwa, bakterie fermentacji mlekowej wykazują również szereg właściwości probiotycznych. Do ich najbardziej istotnych funkcji należą: antagonizm wobec patogenów w przewodzie pokarmowym, stabilizacja mikrobioty jelitowej oraz modulacja odpowiedzi immunologicznej gospodarza [31].
Mechanizmy działania antagonistycznego LAB wobec patogenów
Produkcja bakteriocyn
Jednym z podstawowych mechanizmów działania antagonistycznego LAB wobec mikroorganizmów patogennych jest synteza bakteriocyn – niskocząsteczkowych peptydów o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych. Bakteriocyny produkowane przez LAB wykazują zdolność do selektywnej eliminacji drobnoustrojów blisko spokrewnionych filogenetycznie lub w przypadku niektórych związków, szerokiego spektrum mikroorganizmów, przy jednoczesnym braku toksyczności względem komórek eukariotycznych gospodarza [14].
Do najlepiej scharakteryzowanych bakteriocyn zalicza się nizynę, wytwarzaną głównie przez szczepy Lactococcus lactis. Związek ten należy do grupy lantybiotyków – peptydów zawierających niestandardowe aminokwasy, takie jak lantionina i dehydroalanina, co warunkuje jego wysoką stabilność termiczną oraz skuteczność wobec szerokiego spektrum bakterii Gram-dodatnich, w tym patogenów takich jak Listeria monocytogenes czy Clostridium botulinum [18].
Kolejną istotną bakteriocyną jest pediocyna, syntetyzowana przez szczepy Pediococcus acidilactici oraz Pediococcus pentosaceus. Pediocyna wykazuje silne działanie przeciwdrobnoustrojowe, szczególnie wobec Listeria monocytogenes, co warunkuje jej zastosowanie jako naturalnego środka konserwującego w produktach spożywczych gotowych do spożycia [52].
Wśród mniej znanych, lecz potencjalnie istotnych bakteriocyn, wymienia się sakrocynę, produkowaną przez wybrane szczepy Lactobacillus oraz Leuconostoc. Wykazuje ona aktywność wobec bakterii Gram-dodatnich, a także wybranych Gram-ujemnych, co czyni ją obiektem zainteresowania w kontekście rozwoju naturalnych strategii przedłużania trwałości produktów spożywczych [4].
Synteza bakteriocyn przez LAB jest regulowana wieloma czynnikami środowiskowymi, takimi jak dostępność składników odżywczych, wartość pH środowiska czy obecność innych mikroorganizmów. Zmienność tych parametrów wpływa na ekspresję genów odpowiedzialnych za biosyntezę bakteriocyn, podkreślając ich adaptacyjne znaczenie zarówno w środowiskach fermentacyjnych, jak i w przewodzie pokarmowym gospodarza [11].
Obniżenie pH i zakwaszenie środowiska
Drugim kluczowym mechanizmem działania antagonistycznego LAB wobec drobnoustrojów patogennych i niepożądanych jest zdolność do intensywnej acidyfikacji środowiska, wynikająca z produkcji organicznych związków kwasowych, głównie kwasu mlekowego. Proces fermentacyjnego rozkładu węglowodanów, zwłaszcza glukozy, prowadzi do akumulacji kwasu mlekowego, co skutkuje istotnym obniżeniem pH środowiska do poziomu niesprzyjającego rozwojowi wielu mikroorganizmów patogennych i proteolitycznych [1].
Obniżenie wartości pH poniżej 4,5 znacząco ogranicza zdolność wzrostu i przeżywalność bakterii patogennych, takich jak Listeria monocytogenes, Salmonella spp. oraz Escherichia coli [17]. Skumulowane działanie kwasu mlekowego oraz innych organicznych kwasów – np. octowego czy propionowego – potęguje efekt przeciwdrobnoustrojowy poprzez zakłócenie homeostazy protonowej i pH gradientu między cytoplazmą a środowiskiem zewnętrznym komórki, co prowadzi do destabilizacji funkcji błon komórkowych oraz dezorganizacji procesów metabolicznych [6].
Efekt przeciwdrobnoustrojowy nie wynika wyłącznie z obniżenia pH środowiska, ale także z obecności niezdysocjowanych form kwasów organicznych. W tej formie cząsteczki mogą swobodnie dyfundować przez błony biologiczne do wnętrza komórek mikroorganizmów, gdzie w wyniku dysocjacji uwalniają jony wodorowe, zakwaszając cytoplazmę, prowadząc do denaturacji białek i ostatecznie śmierci komórki [26].
Efektywność działania kwasów organicznych, jako naturalnych czynników konserwujących uzależniona jest od ich rodzaju, stężenia, temperatury otoczenia, wrażliwości mikroorganizmu docelowego oraz właściwości środowiska, takich jak aktywność wody czy zawartość soli [56].
Konkurencja o składniki odżywcze i miejsce adhezji
Jednym z podstawowych mechanizmów antagonistycznego działania bakterii fermentacji mlekowej wobec mikroorganizmów patogennych jest konkurencja o dostęp do ograniczonych zasobów środowiskowych, takich jak składniki odżywcze i miejsca adhezji na powierzchniach komórek gospodarza. Dzięki wysokiej zdolności do szybkiego metabolizowania substratów, LAB skutecznie ograniczają biodostępność kluczowych mikroelementów dla bakterii chorobotwórczych [47]. Szczególnie istotna w tym kontekście jest rywalizacja o żelazo – pierwiastek niezbędny dla proliferacji wielu patogenów, który w organizmach zwierzęcych występuje głównie w postaci związanej z białkami transportującymi i magazynującymi [63].
LAB są zdolne do efektywnego sekwestrowania dostępnych form żelaza zarówno poprzez produkcję sideroforów, jak i za pośrednictwem mechanizmów niezależnych od sideroforów, co stanowi istotną barierę dla kolonizacji i wzrostu patogenów w ekosystemach gospodarza [33]. Oprócz rywalizacji o mikroskładniki, bakterie kwasu mlekowego konkurują również o dostępne nisze ekologiczne, aktywnie zajmując miejsca adhezji na powierzchni nabłonka gospodarza. Zdolność ta ogranicza dostępność receptorów dla drobnoustrojów patogennych i utrudnia ich kolonizację [27].
Adhezja LAB do komórek gospodarza odbywa się za pośrednictwem specyficznych interakcji między powierzchniowymi komponentami bakteryjnymi – takimi jak adhezyny, egzopolisacharydy, lipoteichojowe kwasy – a receptorami obecnymi na powierzchni komórek nabłonkowych [5]. Skuteczna kolonizacja powierzchni śluzówkowych przez LAB nie tylko ogranicza dostęp patogenów do receptorów komórkowych, ale również stymuluje produkcję mucyn, co prowadzi do wzmocnienia bariery fizycznej chroniącej przed penetracją mikroorganizmów chorobotwórczych [32].
Konkurencja o miejsce adhezji stanowi zatem jeden z pierwszych etapów prewencji infekcji, uniemożliwiając patogenom rozpoczęcie procesu kolonizacji i dalszej inwazji [49]. Co więcej, niektóre szczepy LAB mogą modulować ekspresję receptorów komórek nabłonkowych, zmniejszając ich powinowactwo do patogenów i jednocześnie promując adhezję bakterii komensalnych [51]. Tym samym skuteczność działania LAB w kontekście ochrony gospodarza wynika nie tylko z ich aktywności metabolicznej, ale również z właściwości adhezyjnych oraz zdolności do modulowania lokalnego mikrośrodowiska nabłonka.
Tworzenie biofilmu ochronnego
Formowanie biofilmu ochronnego przez bakterie kwasu mlekowego stanowi istotny element ich aktywności antagonistycznej względem mikroorganizmów chorobotwórczych. Biofilmy tworzone przez LAB na powierzchniach komórek nabłonkowych funkcjonują jako bariera fizyczna, skutecznie ograniczająca adhezję oraz kolonizację patogenów [60]. Struktura biofilmu obejmuje komórki bakteryjne otoczone macierzą pozakomórkową, złożoną z polisacharydów, białek, lipidów oraz kwasów nukleinowych. Taka organizacja nie tylko sprzyja utrzymaniu stabilności populacji probiotycznej, lecz również utrudnia dostęp drobnoustrojów chorobotwórczych do receptorów powierzchniowych komórek gospodarza [34].
Zdolność szczepów LAB do tworzenia biofilmu jest determinowana wieloma czynnikami, w tym ekspresją genów kodujących adhezyny, egzopolisacharydy oraz biosurfaktanty, które ułatwiają przyleganie do powierzchni nabłonka oraz wzajemną agregację komórek bakteryjnych. Wytworzony biofilm umożliwia zasiedlenie powierzchni błon śluzowych przez stabilną mikrobiotę, stwarzając jednocześnie warunki niekorzystne dla rozwoju i rozprzestrzeniania się patogenów [9].
Kluczowym aspektem działania ochronnego biofilmu jest również zdolność LAB do modulowania właściwości fizykochemicznych powierzchni, takich jak napięcie powierzchniowe oraz hydrofobowość, co prowadzi do obniżenia zdolności patogenów do adhezji [70]. Ponadto, niektóre szczepy wykazują zwiększoną produkcję substancji przeciwdrobnoustrojowych w warunkach biofilmu, w tym bakteriocyn i kwasów organicznych, co dodatkowo potęguje efekt inhibicji patogenów w lokalnym mikrośrodowisku [7].
Biofilm tworzony przez bakterie probiotyczne pełni nie tylko funkcję bariery mechanicznej, ale także umożliwia efektywniejsze wykorzystanie dostępnych składników odżywczych oraz wspomaga modulację odpowiedzi immunologicznej gospodarza poprzez interakcje z komórkami nabłonka i układu odpornościowego [45]. Szczepy zdolne do formowania biofilmu są w stanie indukować ekspresję cytokin o działaniu przeciwzapalnym oraz modulować aktywność komórek dendrytycznych, co skutkuje wzmożoną odpornością na infekcje bakteryjne [72].
Zdolność do tworzenia biofilmu przez bakterie kwasu mlekowego stanowi zatem wieloaspektowy mechanizm obronny, obejmujący zarówno komponenty fizyczne, jak i czynniki biologiczne, które wspólnie przyczyniają się do ograniczenia kolonizacji organizmu gospodarza przez mikroorganizmy patogenne [34, 60].
Synergistyczne działanie metabolitów LAB
Bakterie kwasu mlekowego (LAB) wytwarzają szereg metabolitów wtórnych, takich jak kwasy organiczne (np. mlekowy, octowy), nadtlenek wodoru, diacetyl, reuteryna oraz bakteriocyny, które wspólnie przyczyniają się do powstawania środowiska niesprzyjającego rozwojowi mikroorganizmów patogennych [2]. Szczególną rolę odgrywają kwasy organiczne, które poprzez obniżenie pH środowiska prowadzą do jego zakwaszenia, co znacząco ogranicza wzrost bakterii preferujących warunki neutralne lub lekko zasadowe [16].
Produkcja nadtlenku wodoru przez LAB generuje stres oksydacyjny w otoczeniu, skutkujący uszkodzeniami błon komórkowych, białek oraz materiału genetycznego drobnoustrojów chorobotwórczych. Działanie to jest dodatkowo intensyfikowane przez obecność innych metabolitów o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych [13]. Diacetyl, będący produktem metabolizmu cytrynianu, wykazuje aktywność antybakteryjną poprzez zaburzanie funkcji enzymatycznych i szlaków metabolicznych, szczególnie u bakterii Gram-ujemnych [38].
Bakteriocyny, będące peptydami o wąskim lub szerokim spektrum działania, eliminują drobnoustroje chorobotwórcze głównie poprzez tworzenie porów w błonie komórkowej lub degradację struktur wewnątrzkomórkowych. Ich aktywność przyczynia się do stabilizacji mikroflory oraz wydłużenia trwałości produktów fermentowanych [19]. Skuteczność działania bakteriocyn jest wzmacniana w środowisku o obniżonym pH, sprzyjając ich przenikaniu przez osłony komórkowe patogenów [71].
Działanie metabolitów wytwarzanych przez LAB nie ogranicza się jedynie do bezpośredniej eliminacji patogenów. Ich aktywność prowadzi również do zakłócenia mechanizmów komunikacji międzykomórkowej mikroorganizmów, co przekłada się na hamowanie formowania biofilmów, syntezy czynników wirulencji oraz mechanizmów obronnych drobnoustrojów wobec stresu środowiskowego [43]. Ponadto, niektóre z tych związków wykazują właściwości immunomodulujące, stymulując odpowiedź immunologiczną gospodarza poprzez regulację produkcji cytokin oraz aktywację komórek układu odpornościowego.
Zintegrowane i synergistyczne działanie metabolitów produkowanych przez LAB umożliwia tworzenie wielopoziomowej ochrony przed kolonizacją i namnażaniem patogenów, szczególnie w obrębie środowisk takich jak przewód pokarmowy czy układ moczowo-płciowy [2, 13].
Definicja i koncepcja biokonserwacji z wykorzystaniem LAB
Biokonserwacja stanowi nowoczesną metodę przedłużania trwałości produktów spożywczych, polegającą na zastosowaniu mikroorganizmów lub ich naturalnych metabolitów w celu ograniczenia rozwoju drobnoustrojów patogennych oraz mikroflory powodującej psucie żywności. W obliczu rosnącego zapotrzebowania konsumentów na żywność minimalnie przetworzoną, wolną od syntetycznych dodatków, koncepcja ta zyskuje na znaczeniu jako alternatywa dla tradycyjnych metod utrwalania [24].
Definicja biokonserwacji obejmuje wykorzystanie naturalnych właściwości antagonistycznych mikroorganizmów oraz produkowanych przez nie związków bioaktywnych, takich jak kwasy organiczne, nadtlenek wodoru czy bakteriocyny, w celu ochrony żywności przed kontaminacją patogenami i zepsuciem. Istotnym założeniem tej strategii jest jednoczesne zachowanie wartości odżywczej i właściwości sensorycznych produktów [10]. W tym kontekście bakterie kwasu mlekowego (LAB) pełnią podwójną funkcję: działają jako naturalne konserwanty biologiczne oraz jako czynniki wspierające bezpieczeństwo mikrobiologiczne, zwłaszcza w produktach fermentowanych i minimalnie przetworzonych [23].
Koncepcja biokonserwacji zakłada nie tylko bezpośrednią inhibicję mikroorganizmów niepożądanych, lecz także modulację mikrobioty zasiedlającej produkt w kierunku dominacji drobnoustrojów korzystnych dla jakości i trwałości żywności [66]. Zdolność LAB do tworzenia biofilmów ochronnych, konkurowania o miejsca adhezji oraz składniki odżywcze, jak również produkcji związków zakłócających quorum sensing patogenów, czyni je szczególnie efektywnymi czynnikami biokonserwującymi [41].
Implementacja LAB, jako biokonserwantów, może przyjmować formę inokulacji produktów odpowiednio dobranymi kulturami ochronnymi, które konkurują z mikroflorą niepożądaną, bądź też zastosowania oczyszczonych metabolitów tych bakterii, takich jak bakteriocyny, jako naturalnych dodatków przeciwdrobnoustrojowych [36]. Kluczowym determinantem skuteczności procesów biokonserwacyjnych z udziałem LAB jest trafny dobór szczepu probiotycznego, uwzględniający specyfikę danego produktu spożywczego, warunki jego przechowywania oraz oczekiwania konsumenckie dotyczące jakości sensorycznej [24].
Ograniczenia technologiczne, sensoryczne i regulacyjne
Pomimo licznych korzyści wynikających z wykorzystania bakterii kwasu mlekowego (LAB) jako czynników biokonserwujących w technologii żywności, implementacja tej strategii napotyka szereg istotnych ograniczeń o charakterze technologicznym, sensorycznym oraz regulacyjnym.
Na poziomie technologicznym kluczowym wyzwaniem pozostaje utrzymanie stabilności oraz biologicznej aktywności kultur ochronnych w zmiennych warunkach przetwórstwa i przechowywania. Wahania temperatury, zmienność pH oraz ograniczona dostępność składników odżywczych mogą istotnie wpływać na żywotność i efektywność działania szczepów LAB [24]. W szczególności produkty o wysokiej zawartości soli, niskim pH lub ubogie w substancje odżywcze stanowią środowisko niesprzyjające utrzymaniu aktywności bakterii mlekowych, co może prowadzić do obniżenia skuteczności biokonserwacji [72].
Z perspektywy sensorycznej, obecność metabolitów wtórnych produkowanych przez LAB – takich jak kwasy organiczne, diacetyl czy inne związki aromatyczne – może wpływać na cechy organoleptyczne produktów spożywczych. Nadmierna produkcja tych substancji może powodować zmiany smaku, zapachu, a nawet tekstury żywności, co nie zawsze jest akceptowalne z punktu widzenia konsumentów [36]. Przykładowo, nadmierne zakwaszenie wyrobów mięsnych lub produktów mleczarskich może prowadzić do pogorszenia ich jakości sensorycznej oraz obniżenia akceptacji rynkowej [41].
Ograniczenia o charakterze regulacyjnym stanowią kolejną barierę dla szerokiego wdrożenia technologii biokonserwacyjnych. W wielu jurysdykcjach stosowanie żywych mikroorganizmów lub ich metabolitów jako składników żywności podlega ścisłym przepisom prawnym, które wymagają m.in. uzyskania statusu GRAS (Generally Recognized As Safe) lub innych certyfikatów bezpieczeństwa [23]. Dodatkowo, niejednolite regulacje pomiędzy różnymi regionami – np. pomiędzy Unią Europejską a Stanami Zjednoczonymi – mogą utrudniać komercjalizację produktów biokonserwowanych na rynku międzynarodowym [10]. Istotnym aspektem ograniczającym wykorzystanie LAB w biokonserwacji jest również potencjalne ryzyko związane z poziomym transferem genów, w tym genów oporności na antybiotyki lub innych niepożądanych cech. Chociaż większość szczepów stosowanych w biokonserwacji wykazuje wysoki profil bezpieczeństwa, ich użycie wymaga szczegółowej analizy genotypowej oraz oceny ryzyka, co wiąże się z dodatkowymi kosztami wdrażania nowych preparatów mikrobiologicznych [72].
dr inż. Adriana Łobacz
Katedra Mleczarstwa i Zarządzania Jakością
Wydział Nauki o Żywności
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
mgr inż. Joanna Niewińska
Katedra Mleczarstwa i Zarządzania Jakością
Wydział Nauki o Żywności
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
dr hab. inż. Jarosław Kowalik, prof. UWM
Katedra Mleczarstwa i Zarządzania Jakością
Wydział Nauki o Żywności
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
dr hab. inż. Justyna Żulewska, prof. UWM
Katedra Mleczarstwa i Zarządzania Jakością
Wydział Nauki o Żywności
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
Literatura
- Arena M.P., Capozzi V., Russo P., Drider D., Spano G., Fiocco D. (2016). Lactobacillus plantarum as a strategy for an efficient production of food-grade biopreservatives. Frontiers in Microbiology, 7, 464.
- Arena M.P. (2018). Probiotic abilities of Lactobacillus strains isolated from fermented olives: focus on the synthesis of functional metabolites. Frontiers in Microbiology, 9, 595.
- Axelsson L. (2004). Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In: Salminen, S., von Wright, A. (eds), Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects (3rd ed.). Marcel Dekker.
- Azevedo A. C., Bento C.B.P., Ruiz J.C., Queiroz M.V. (2015). Bacteriocins from lactic acid bacteria: production, purification and food applications. Brazilian Journal of Microbiology, 46(1), 1-10.
- Bermudez-Brito M., Plaza-Diaz J., Munoz-Quezada S., Gomez-Llorente C., Gil A. (2012). Probiotic mechanisms of action. Annals of Nutrition and Metabolism, 61(2), 160-174.
- Bintsis T. (2018). Lactic acid bacteria: their applications in foods. Journal of Bacteriology and Mycology, 6(2), 89-94.
- Burgain J., Gaiani C., Linder M., Scher J. (2014). Encapsulation of probiotic living cells: From laboratory scale to industrial applications. Journal of Food Engineering, 104(4), 467-483.
- Carpentier B., Cerf O. (2011). Review – Persistence of Listeria monocytogenes in food industry equipment and premises. International Journal of Food Microbiology, 145(1), 1-8. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2011.01.005.
- Castro-Bravo N., Wells J.M., Margolles A. (2018). Interactions of surface molecules from probiotics with the host mucosa. Microbial Cell Factories, 17(1), 37.
- Chen H., Hoover D.G. (2003). Bacteriocins and their food applications. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2(3), 82-100.
