Przegląd Mleczarski 11/2025 – Ser jako żywy ekosystem – fascynujące dojrzewanie sera Fiore Sardo - Polska Rolna

Przegląd Mleczarski 11/2025 – Ser jako żywy ekosystem – fascynujące dojrzewanie sera Fiore Sardo

02 grudnia 2025 r.

Wśród wszystkich produktów mlecznych ser charakteryzuje się najbardziej złożoną strukturą matrycy [1]. Bardzo złożony proces jego dojrzewania obejmuje szereg wzajemnie powiązanych reakcji biochemicznych, w których białka, tłuszcze i węglowodany ulegają stopniowemu rozkładowi do związków o niskiej masie cząsteczkowej, nadających produktowi finalnemu odpowiednią teksturę i smak.

Dojrzewanie sera Fiore Sardo
Kluczową rolę w dojrzewaniu sera odgrywają bakterie kwasu mlekowego – zarówno poprzez wytwarzanie kwasu w początkowej fazie fermentacji, jak i poprzez aktywny udział w późniejszych etapach dojrzewania sera. Ta zróżnicowana grupa mikroorganizmów (obejmująca, m.in. pałeczki kwasu mlekowego, pediokoki, enterokoki oraz bakterie z rodzaju Leuconostoc) działa w sposób synergiczny, kształtując charakterystyczny profil sensoryczny serów twardych i półtwardych. W przypadku serów rzemieślniczych wytwarzanych z mleka surowego, źródłem tej flory bakteryjnej jest naturalne, mikrobiologiczne środowisko mleka, otoczenia produkcyjnego oraz stosowanych narzędzi i sprzętu [2].

Proces dojrzewania sera Fiore Sardo przebiega w dwóch etapach. Pierwszy, trwający do dwóch tygodni, odbywa się tradycyjnie w bacówkach, gdzie sery układa się na słomianych matach z sitowia, zawieszonych w zadymionej części nad kominkiem. Tam są one poddawane naturalnemu wędzeniu przez około 2 godziny dziennie w temperaturze 18-20°C. Do wędzenia wykorzystuje się drewno roślin charakterystycznych dla obszaru śródziemnomorskiego, głównie chruściny jagodnej (drzewo poziomkowe), pistacji kleistej (lentyszka), mirtu zwyczajnego oraz dębu ostrolistnego. Drugi etap, właściwego dojrzewania, przebiega zazwyczaj już w gospodarstwach, w temperaturze otoczenia, nieprzekraczającej 15°C. Wraz z nadejściem cieplejszych miesięcy sery przenosi się do chłodnych, podziemnych piwnic, często położonych w rejonach górskich. Cały proces trwa co najmniej 3,5 miesiąca – w przypadku serów stołowych i minimum 6 miesięcy – w przypadku serów przeznaczonych do tarcia [3, 4, 5].

Ze względu na duże rozmiary sera Fiore Sardo oraz długotrwały proces solenia [6], tak jak i w większości włoskich serów twardych, obserwuje się spadkowy gradient stężenia NaCl – od powierzchni ku wnętrzu, odwrotny gradient aktywności wody oraz – w niektórych przypadkach – gradient temperatury przebiegający od środka ku powierzchni. Zjawiska te utrzymują się przez dłuższy czas, a dojrzewanie może przebiegać w sposób zróżnicowany w zależności od warstwy sera. W efekcie szybszy i bardziej intensywny rozwój mikroflory następuje w jego zewnętrznych partiach [6].

Profil mikrobiologiczny sera Fiore Sardo podczas dojrzewania
Fiore Sardo stanowi doskonały przykład na to, że ser jest „produktem żywym, podlegającym nieustannej i dynamicznej ewolucji” [3]. Zmiany te, zachodzące głównie dzięki obecności rodzimej mikroflory [7], stanowią swoisty „odcisk palca” każdego pasterza-serowara [8]. Mikroflora tego sera odpowiada profilowi charakterystycznemu dla serów niedogrzewanych, wytwarzanych z surowego mleka owczego [9]. Tworzą ją głównie (tab. 1) mezofilne bakterie kwasu mlekowego – paciorkowce Lactococcus lactis subsp. lactis, pałeczki Lactobacillus plantarum, Lb. casei, Lb. pentosus, Lb. paracasei, Lb. brevis oraz Lactobacillus fermentum – a także ziarniaki z rodzaju Enterococcus (Enterococcus faecium) [4, 9]. Jest to naturalny, genetycznie zróżnicowany ekosystem mikrobiologiczny, aktywnie uczestniczący w procesie dojrzewania sera [3, 10]. Drobnoustroje te, jako element mikroflory środowiskowej, pochodzącej z udoju i procesu wytwarzania, występują w Fiore Sardo w zmiennej liczebności, co wynika z przypadkowych czynników związanych ze zmianami warunków środowiskowych w trakcie sezonu produkcyjnego. Taka zmienność jest cechą typową dla tradycyjnych serów rzemieślniczych, których produkcja jest ściśle powiązana z sezonowością pozyskiwania mleka [11].

Tabela 1. Reprezentatywne gatunki bakterii wyizolowane z sera Fiore Sardo

W owczych serach z mleka surowego populacja niestarterowych bakterii kwasu mlekowego NSLAB (ang. Non-Starter Lactic Acid Bacteria) tworzy złożony zespół mikroorganizmów obejmujący liczne gatunki i biotypy. Ich różnorodność wynika zarówno z szeregu selektywnych warunków towarzyszących procesowi produkcji, jak i z obecności różnych nisz ekologicznych. W połączeniu z gatunkami sporadycznie spotykanymi w mleku, tworzą one specyficzne ekosystemy mleczarskie, które stanowią dominującą część flory bakteryjnej wielu dojrzewających serów twardych [3].

Na współwystępowanie różnorodnych bakterii kwasu mlekowego w serach wpływa wiele czynników. Odmienny stopień ich przystosowania do środowiska sera może wynikać z antagonizmów związanych z wytwarzaniem związków o działaniu hamującym i/lub z konkurencją o dostępne składniki odżywcze [12]. W szczególności szczep Lactobacillus plantarum wyróżnia się wysoką zdolnością adaptacyjną do wykorzystania złożonych substratów obecnych w surowym mleku owczym [9].

W większości serów dojrzewających z mleka surowego dominującą grupę NSLAB stanowią mezofilne gatunki, m.in. Lactobacillus paracasei oraz L. plantarum. Mikroorganizmy te, dzięki swojej aktywności biochemicznej, uwalniają do masy serowej wolne peptydy, aminokwasy i kwasy tłuszczowe, co przyspiesza proces dojrzewania i wzmacnia profil smakowy sera. Poza zdolnościami fermentacyjnymi i proteolitycznymi, autochtoniczne szczepy wykazują także działanie antagonistyczne wobec patogenów i mikroflory saprofitycznej odpowiedzialnej za psucie żywności. Obecność rodzimych bakterii kwasu mlekowego sprzyja wytwarzaniu, jako głównych produktów końcowych ich metabolizmu, szeregu związków o właściwościach przeciwdrobnoustrojowych, w tym kwasów organicznych, nadtlenku wodoru, etanolu oraz bakteriocyn. Dzięki temu sery uzyskują wysoki poziom bezpieczeństwa mikrobiologicznego, a rozwój przenoszonych przez żywność patogenów, takich jak Listeria monocytogenes, Escherichia coli O157:H7 czy Yersinia enterocolitica zostaje skutecznie zahamowany [12]. W przypadku współwystępowania w serze różnych szczepów mezofilnych pałeczek i ziarniaków bakterii kwasu mlekowego (np. Lactococcus lactis subsp. lactis, Lactobacillus casei, L. plantarum) występuje efekt synergistyczny, który istotnie przyspiesza tempo ich wzrostu [13] (tab. 2).

Tabela 2. Liczebność głównych grup mikroorganizmów w serze Fiore Sardo po 12 miesiącach dojrzewania

Źródło: [14]

Wyjątkowość bakterii NSLAB wynika z ich zdolności do wzrostu w trakcie dojrzewania sera oraz produkcji endopeptydaz aktywnych w warunkach panujących w serze, które silnie przyczyniają się do wtórnej proteolizy. Warto podkreślić, że wnętrze sera nie stanowi przyjaznego środowiska dla wielu innych mikroorganizmów, co wynika z szeregu czynników, takich jak niskie pH, wysoka zawartość soli, brak fermentowalnych węglowodanów oraz obecność bakteriocyn [14]. Największą i najbardziej zróżnicowaną część populacji NSLAB w serze Fiore Sardo stanowią fakultatywnie heterofermentatywne mezofilne pałeczki kwasu mlekowego (FHL, ang. Facultatively Heterofermentative Lactobacilli), w skład których wchodzą, m.in. Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum i Lactobacillus curvatus. Skład populacji FHL zależy od rodzaju sera, a ich obecność jest zawsze powiązana z enterokokami, które występują w znacznie mniejszej liczbie [3, 9, 11, 15, 16] (tab. 2).

Poza bakteriami NSLAB w serze mogą występować również bakterie aromatyzujące z rodzajów Pediococcus i Leuconostoc, a także paciorkowce [3, 15]. Paciorkowce odgrywają istotną rolę w utrzymywaniu równowagi mikrobiomu sera, prawdopodobnie ograniczając rozwój szkodliwych bakterii z rodzaju Clostridium odpowiedzialnych za późne wzdęcia serów [9]. Na początku dojrzewania w serze Fiore Sardo stwierdzono także niską liczebność drożdży i pleśni, z dominującymi gatunkami: Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica oraz Geotrichum candidum. Gatunki te wykazują zdolność wzrostu w niskich temperaturach (~10°C) oraz tolerancję na wysoką zawartość soli (6% NaCl) [17]. Dwa ostatnie gatunki utrzymywały się w serze do trzeciego miesiąca dojrzewania [4]. Drożdże w serze Fiore Sardo pozytywnie wpływają na jego charakterystyczny smak i aromat w fazie dojrzewania. Szczególnie ważna jest rola Debaryomyces hansenii, który fermentując glukozę oraz asymilując kwas mlekowy i cytrynowy, wytwarza związki smakowo-zapachowe nadające alkoholowy, kwaskowaty i „serowy” posmak, wzbogacając profil sensoryczny sera [18]. Najbardziej prawdopodobnym źródłem drożdży w serze jest środowisko produkcyjne, w tym powietrze, sprzęt oraz osoby pracujące w zakładzie. Różnorodność gatunkowa i liczebność drożdży mogą się różnić nie tylko między różnymi zakładami, ale także w kolejnych dniach produkcji w tym samym zakładzie, co związane jest z odmiennymi warunkami środowiskowymi [17]. Spadek populacji drożdży w trakcie dojrzewania wynika prawdopodobnie z ograniczonej dyfuzji tlenu w zwartej matrycy sera oraz ze znacznej i szybkiej redukcji zawartości wody [4] (tab. 2).

W związku z tym głównymi mikroorganizmami obecnymi w serze Fiore Sardo przez cały okres dojrzewania są mezofilne bakterie kwasu mlekowego (stanowiące dominującą grupę NSLAB) oraz enterokoki. W serach wytwarzanych z surowego, niepasteryzowanego mleka charakterystyczne jest, że naturalna mikroflora, złożona głównie z mezofilnych NSLAB, początkowo obecna w niewielkiej liczbie, z czasem osiąga wysoką liczebność żywych komórek. Mikroorganizmy te odgrywają istotną rolę w kształtowaniu smaku i tekstury sera, prawdopodobnie dzięki udziałowi w proteolizie białek i degradacji aminokwasów. Dzięki bogatemu zestawowi enzymów proteolitycznych i hydrolitycznych, bakterie te są uważane za ważny czynnik przyspieszający dojrzewanie sera [19] (tab. 2).

Ewolucja mikrobioty w procesie dojrzewania sera Fiore Sardo – sukcesja mikrobiologiczna
Podczas dojrzewania serów często obserwuje się sukcesję populacji mikrobiologicznych, determinowaną zarówno warunkami produkcji oraz dojrzewania, jak i wzajemnymi interakcjami między mikroorganizmami. Szczepy dominujące na wczesnym etapie produkcji niekoniecznie utrzymują swoją obecność w późniejszych fazach dojrzewania. W twardych serach matryca i panujące w niej warunki środowiskowe sprzyjają głównie autochtonicznym, mezofilnym bakteriom kwasu mlekowego LAB (ang. Lactic Acid Bacteria). Wynika to z ograniczonej dostępności laktozy i innych węglowodanów fermentujących, niskiego pH, obniżonej aktywności wody (głównie na skutek solenia), odpowiedniej temperatury oraz obecności bakteriocyn. W takich warunkach bakterie NSLAB, nienaruszone podczas wytwarzania sera (np. przez termizację mleka lub dogrzewanie gęstwy), pozostają aktywne metabolicznie i podlegają dynamicznej dystrybucji w trakcie dojrzewania. Mogą one pochodzić zarówno z naturalnej mikroflory mleka surowego, jak i z mikroorganizmów „przybyszowych”, które trafiają do sera ze środowiska produkcyjnego, na przykład z powierzchni sprzętu mającego kontakt z mlekiem i serem [9]. Ewolucja mikroflory mlekowej w serach z ChNP jest szczególnie interesująca, gdyż jej aktywność biochemiczna w trakcie produkcji, zwłaszcza mezofilnych LAB, zdolnych do fermentacji cytrynianów, odgrywa istotną rolę w kształtowaniu cech organoleptycznych sera podczas dojrzewania [3]. Badania dotyczące zmian gatunkowych NSLAB w serze Fiore Sardo wskazują, że ich dynamika jest zbliżona do obserwowanej w innych serach wytwarzanych z surowego mleka owczego [4].

Populacja żywych komórek NSLAB zazwyczaj osiąga szczyt po około 24 godzinach dojrzewania, kiedy szybko rozwijające się pałeczki FHL osiągają liczebność powyżej 10⁹ jtk/g. W innym badaniu zaobserwowano następującą dynamikę NSLAB w serze Fiore Sardo: 10⁵ jtk/g w serze jednodniowym, wzrost do 10⁸ jtk/g po 30 dniach – co czyni je dominującą grupą drobnoustrojów w pierwszych trzech miesiącach dojrzewania, dzięki odporności na wysokie stężenie soli i niskie pH [2]. Następnie liczebność stopniowo spada do 10⁴ jtk/g po 7 miesiącach, co prawdopodobnie wynika z działania niskiego pH, ograniczonej aktywności wody i wysokiego stężenia NaCl [3]. Podobna ewolucja populacji FHL, z przewagą gatunków L. plantarum i L. paracasei, została zaobserwowana w innych serach wytwarzanych z mleka surowego, takich jak Comté czy sery szwajcarskie [19]. Te bakterie stanowią dominującą mikroflorę fermentacyjną, która po przefermentowaniu laktozy uczestniczy w proteolizie w dalszych etapach dojrzewania [13].

W początkowej fazie dojrzewania Fiore Sardo (do ok. 30 dni) dominują ziarniaki mlekowe oraz E. faecium, a także gatunki Lc. lactis ssp. lactis, Lb. plantarum i Lb. casei. Z czasem trzy ostatnie zaczynają przeważać w populacji. Mikroflora ta, dobrze przystosowana do warunków środowiskowych sera, odgrywa aktywną rolę na początku dojrzewania, a w późniejszych etapach – bierną – w wyniku uwalniania enzymów wewnątrzkomórkowych po autolizie komórek bakteryjnych. Dzięki tej aktywności biochemicznej enzymy bakterii mają natychmiastowy dostęp do matrycy sera [3, 4]. Na wczesnym etapie dojrzewania sera Fiore Sardo kluczową rolę w szybkiej fermentacji odgrywa przede wszystkim L. lactis subsp. lactis, znany ze swojej zdolności do intensywnego ukwaszania. Populacja tego szczepu szybko rośnie w masie serowej, osiągając około 7 log₁₀ jtk/g, a maksymalną liczebność – ok. 10 log₁₀ jtk/g – notuje zwykle około 30 dnia dojrzewania. Następnie liczebność stopniowo spada, co prawdopodobnie jest efektem działania niskiego pH, ograniczonej aktywności wody oraz wysokiego stężenia NaCl. Wysoka zdolność ukwaszająca L. lactis subsp. lactis sprzyja aktywności enzymów podpuszczkowych i hamuje rozwój mikroflory wrażliwej na kwas, w tym drobnoustrojów psujących lub potencjalnie szkodliwych. Proces fermentacji korzystnie wpływa na jakość mikrobiologiczną i technologiczną sera, w tym jego strukturę. Dodatkowo L. lactis subsp. lactis może wytwarzać bakteriocyny – zazwyczaj peptydowe związki hamujące wzrost wielu potencjalnie patogennych mikroorganizmów, np. L. monocytogenes [9].

W późniejszych etapach dojrzewania sera Fiore Sardo dominują różne gatunki fakultatywnie heterofermentatywnych bakterii kwasu mlekowego (FHL), przede wszystkim Lb. plantarum, Lb. casei oraz Lb. pentosus, choć izolowano również Lb. brevis, Lb. curvatus, Lb. buchneri i Lb. fermentum [6, 9]. Liczna populacja NSLAB, utrzymująca się przez wiele miesięcy dojrzewania na poziomie około 10⁷–10⁸ jtk/g [20], stanowi typową cechę większości serów twardych [9]. W ciągu pierwszych 150 dni dojrzewania sera Fiore Sardo populacja początkowo licznych szczepów Lb. plantarum stopniowo zmniejsza się, a w kolejnych fazach dojrzewania coraz bardziej dominują Lb. brevis i Lb. casei. Natomiast liczebność L. paracasei utrzymuje się na stałym poziomie lub wzrasta nawet do około 90 dnia dojrzewania [9]. Analiza ewolucji mikroflory podczas dojrzewania wykazała, że L. paracasei staje się gatunkiem dominującym, pełniącym rolę regulatora mikroflory w końcowej fazie dojrzewania sera. Ze względu na odporność na ograniczenia środowiskowe dojrzałego sera – niską aktywność wody, wysokie stężenie soli oraz ograniczoną dostępność składników odżywczych [21] – gatunek ten aktywnie uczestniczy w proteolizie i innych procesach enzymatycznych zachodzących podczas dojrzewania. Jego zdolność do wzrostu w temperaturze 45°C podkreśla znaczenie utrzymania naturalnej, dzikiej mikroflory w serach z mleka surowego [3, 19, 21]. Podobnie jak w przypadku sera Pecorino Sardo, szczepy dominujące w początkowych etapach dojrzewania,niekoniecznie utrzymują się do końca procesu. Na przykład L. curvatus wykrywano jedynie we wczesnych fazach dojrzewania. W końcowej fazie dojrzewania sera Fiore Sardo istotne jest utrzymanie stosunkowo licznej populacji mezofilowych pałeczek kwasu mlekowego FHL, które fermentując cytryniany [3] do pirogronianu, octanu i acetoiny, przyczyniają się do kształtowania charakterystycznego smaku i aromatu [19]. Szczególnie znaczącą rolę odgrywają Lb. plantarum i Lb. casei – ich wysoka aktywność proteolityczna [13] uczestniczy we wtórnej proteolizie, hydrolizując gorzkie peptydy i wytwarzając unikalny profil aromatyczny Fiore Sardo [9].

Między serami pochodzącymi z różnych gospodarstw mogą występować różnice w udziale szczepów tworzących populację fakultatywnie heterofermentatywnych pałeczek kwasu mlekowego (FHL). Zmienność w składzie gatunkowym FHL w serze Fiore Sardo może wynikać z odmiennych cech mikrobiologicznych surowego mleka, warunków panujących w zakładzie produkcyjnym oraz sezonu wytwarzania. Szczególnie istotne jest środowisko mleczarskie, które może stanowić trwały rezerwuar pałeczek kwasu mlekowego, tworząc mikroflorę charakterystyczną dla konkretnego gospodarstwa, co nadaje serom indywidualny profil smakowy typowy dla produktów z mleka surowego [9, 19].

Analiza fenotypowa mikroorganizmów zasiedlających ser Fiore Sardo pokazuje, że wraz z dominującymi FHL NSLAB zawsze obecne są enterokoki, głównie E. faecalis i E. faecium [16], uznawane za typową i powszechną mikroflorę serów owczych z mleka surowego [2, 3]. Gatunki te wykazują przypuszczalnie wysoką aktywność lipolityczną [3], a ich liczebność wzrasta w miarę postępu dojrzewania sera [19]. Pochodzą głównie z mleka surowego, szczególnie przechowywanego i transportowanego bez chłodzenia, przy czym istotną rolę odgrywa również wyposażenie produkcyjne. Z drugiej strony ich obecność często wiąże się z niskimi standardami higieny podczas udoju i przechowywania mleka, dlatego wykorzystuje się je jako wskaźnik higieny produkcji [2, 3].

enterokoków, szczególnie w końcowych etapach dojrzewania, jest charakterystyczna dla rzemieślniczych serów owczych [10, 21]. W przypadku Fiore Sardo populacja Enterobacteriaceae, początkowo stosunkowo wysoka, spada do niewykrywalnego poziomu po 90 dniach dojrzewania. Jest to efektem rosnącego stężenia soli, działania antagonistycznej mikroflory, głównie LAB, która hamuje rozwój Enterobacteriaceae, poprzez obniżenie pH do 5,0–5,2 oraz obecności związków przeciwdrobnoustrojowych, takich jak bakteriocyny, kwasy organiczne, dwutlenek węgla, etanol, nadtlenek wodoru i diacetyl [2]. Stopniowy zanik tych bakterii jest korzystny, gdyż ich obecność mogłaby prowadzić do psucia sera [3]. W całym okresie dojrzewania jedynym izolowanym enterokokiem był Enterococcus faecium, obecny także w 9-miesięcznym serze. Liczne badania wskazują, że enterokoki mogą dominować w pełni dojrzałych serach typowych dla krajów śródziemnomorskich [11]. Dzięki swojej aktywności biochemicznej uczestniczą one w procesie dojrzewania, przyczyniając się do kształtowania smaku, aromatu i struktury sera [13]. Charakterystycznym zjawiskiem w Fiore Sardo jest także znaczny spadek populacji bakterii coli między 48 godziną a pierwszym miesiącem dojrzewania, najprawdopodobniej w wyniku obniżenia pH przez bakterie kwasu mlekowego, spadku wilgotności oraz równoległego wzrostu stężenia soli w serze [4].

Analiza chemometryczna pozwoliła zidentyfikować metabolity, które ulegają największym zmianom podczas dojrzewania sera. Oprócz szybkiego początkowego spadku laktozy metabolizowanej przez LAB, a następnie kwasu cytrynowego i mlekowego, w końcowej fazie dojrzewania obserwowano powstawanie krótszych peptydów i wolnych aminokwasów. Fermentacja laktozy stanowi kluczowy etap biochemiczny dla uzyskania wysokiej jakości sera, ponieważ nawet niewielka jej resztkowa pozostałość może sprzyjać rozwojowi niepożądanej mikroflory wtórnej. Kwasy organiczne, jako główne produkty katabolizmu węglowodanów przez LAB, pełnią podwójną rolę: są zarówno źródłem węgla dla innych mikroorganizmów, jak i produktami pośrednimi w licznych reakcjach biochemicznych. Najobficiej występujący kwas mlekowy odpowiada przede wszystkim za zmiany pH sera – początkowy jego wzrost, a następnie spadek w miarę wykorzystywania przez rodzimą mikrobiotę sera. Spadek zawartości kwasu cytrynowego w trakcie dojrzewania może być związany z aktywnością szczepów metabolizujących cytryniany (Lb. paracasei, Lb. plantarum, E. faecium) do pirogronianów i octanów. W tym samym czasie rośnie stężenie kwasu octowego, który odgrywa istotną rolę w kształtowaniu smaku sera oraz wykazuje działanie hamujące wobec bakterii Gram-ujemnych. Kwas octowy powstaje głównie w wyniku metabolizmu kwasu cytrynowego i mlekowego, choć może również powstawać z mleczanów lub w wyniku katabolizmu aminokwasów [2]. Metabolity bakteryjne, takie jak kwas cytrynowy i mlekowy, a także produkty powstałe w wyniku lizy komórek bakteryjnych, uważane są za potencjalne źródła energii dla bakterii kwasu mlekowego po wyczerpaniu laktozy [3].

Badania nad dodatkiem do mleka startera stanowiącego mieszaninę szczepów autochtonicznych, wykazały jego wpływ na rozwój mikroflory typu NSLAB. Sery eksperymentalne, wyprodukowane z wykorzystaniem wybranych kultur autochtonicznych, cechowały się lepszą jakością, zwłaszcza pod względem kształtu, tekstury, rozmieszczenia oczek i smaku. Ponadto, obecność startera przyspieszała eliminację niepożądanej mikroflory, podkreślając rolę surowego mleka owczego jako źródła szczepów o wartości technologicznej, istotnych dla uzyskania wysokiej jakości serów rzemieślniczych [7].

Opisana powyżej sukcesja mikrobiologiczna wydaje się odgrywać kluczową rolę w „późnym” dojrzewaniu sera, kiedy zachodzi intensywna proteoliza wtórna. Proces ten prowadzi do wzrostu stężenia niskocząsteczkowych peptydów i aminokwasów, co przypisuje się aktywności peptydaz mezofilnych NSLAB [15]. Zachowanie różnorodności biologicznej podczas dojrzewania serów z surowego mleka owczego jest niezwykle istotne. Stosowanie rodzimych kultur bakterii i grzybów umożliwia zachowanie tradycyjnych cech sensorycznych tych produktów [16].

Proteoliza podczas dojrzewania sera Fiore Sardo
Proteoliza uznawana jest za kluczowy i najbogatszy w reakcje proces biochemiczny zachodzący podczas dojrzewania sera. W twardych serach rozkład białek odbywa się w całej masie serowej, w warunkach beztlenowych. Głównymi czynnikami proteolitycznymi odpowiedzialnymi za proteolizę w serach są: (1) natywne proteazy mleka, takie jak plazmina i katepsyna D, (2) podpuszczka lub inne enzymy koagulujące pozostające w skrzepie (w zależności od źródła i intensywności dogrzewania) oraz (3) proteazy i peptydazy pochodzenia mikrobiologicznego. Na wczesnym etapie dojrzewania, w trakcie proteolizy pierwotnej, głównie enzymy podpuszczkowe rozkładają kazeiny do dużych peptydów, co znacząco zmienia teksturę sera. Następnie polipeptydy są dalej degradowane przez system proteinaza–peptydaza bakterii NSLAB w serach z mleka surowego, prowadząc do powstania mniejszych peptydów i wolnych aminokwasów [6, 9].

Proteoliza w twardych serach owczych przebiega powoli, co wynika z wysokiego stężenia soli i niskiej zawartości wody. Proces ten dzieli się na proteolizę pierwotną i wtórną. Pierwotną przeprowadzają enzymy, takie jak chymozyna, plazmina oraz enzymy termofilnych bakterii kwasu mlekowego, natomiast proteoliza wtórna, bardziej rozległa, polega na katabolizmie wolnych aminokwasów (FAA ang. Free Amino Acids) za sprawą peptydaz i innych enzymów pochodzących od rodzimych bakterii kwasu mlekowego (NSLAB) [9].

Zastosowanie podpuszczki o różnym stosunku chymozyny do pepsyny powoduje odmienne zmiany proteolityczne w serze. W przypadku tradycyjnej podpuszczki jagnięcej stosowanej przy produkcji Fiore Sardo, zawartość chymozyny maleje wraz z wiekiem zwierzęcia, podczas gdy zawartość pepsyny rośnie. Pepsyna, będąca enzymem o szerokiej specyficzności, odpowiada za gorzki smak sera, ponieważ przewaga peptydów hydrofobowych nad hydrofilowymi wywołuje odczucie goryczki. Z kolei użycie rzemieślniczej podpuszczki jagnięcej przyspiesza powstawanie frakcji azotu rozpuszczalnego w wodzie WSN oraz azotu niebiałkowego. Prawdopodobnie wynika to zarówno z wysokiej retencji chymozyny w skrzepie, jak i z jej złożonego systemu proteolitycznego. W przypadku podpuszczki o wysokiej aktywności wobec αs1-kazeiny, degradacja tej frakcji przebiega stosunkowo szybko. Analiza składu frakcji WSN wskazuje, że stosunek chymozyny do pepsyny w koagulancie wpływa na „jakościowy” charakter proteolizy, czego dowodem są proporcje między związkami hydrofilowymi i hydrofobowymi. Wyższy poziom WSN w serze wytwarzanym przy użyciu przemysłowej jagnięcej podpuszczki wskazuje na obecność pepsyny, co zwiększa ogólną aktywność proteolityczną koagulantu [22].

Produkty proteolizy wpływają na smak sera zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio, działając jako prekursory związków smakowych [23]. Znajomość przebiegu procesów proteolitycznych pozwala lepiej zrozumieć różnorodność smakową serów. Na przykład oligopeptydy kazeinowe mają istotny wpływ na intensywność smaku, a poszczególne peptydy mogą nadawać serowi charakterystyczne walory smakowe [24].

Zasadniczo proteoliza w włoskich serach twardych przebiega podobnie jak w innych twardych i półtwardych serach dojrzewających wewnętrznie z udziałem bakterii. Na proces ten wpływają cechy charakterystyczne dla tego typu serów, takie jak niska wilgotność, wysokie stężenie soli, utrzymywanie się gradientów NaCl i temperatury oraz brak rozwoju pleśni [6]. Dodatkowo na intensywność proteolizy mogą oddziaływać miejsce i sezon produkcji, długość dojrzewania oraz rodzaj serowni. Badania wykazują również, że sery produkowane z mleka surowego cechują się bardziej złożonym profilem peptydowym i intensywniejszą proteolizą w porównaniu do serów z mleka pasteryzowanego lub termizowanego [15].

W niedogrzewanym serze Fiore Sardo proteoliza pierwotna w pierwszej fazie dojrzewania jest wywoływana przez aktywność proteolityczną koagulantu. Powstające w tym procesie peptydy stanowią substrat do dalszej hydrolizy przez enzymy bakterii kwasu mlekowego, prowadząc do powstania mniejszych peptydów i wolnych aminokwasów FAA. Chymozyna zawarta w podpuszczce skutecznie rozkłada αs1-kazeinę (αs1-CN), natomiast termicznie stabilna plazmina mleka degraduje β-kazeinę (β-CN), tworząc przy tym γ-kazeinę (γ-CN) [15]. W ciągu 240 dni dojrzewania αs1-kazeina ulega niemal całkowitej degradacji, podczas gdy β-kazeina, bardziej odporna na enzymy podpuszczkowe, jest częściowo rozkładana przez plazminę. Profil temperaturowy Fiore Sardo, nieprzekraczający 40°C podczas obróbki ziarna serowego, sprzyja dominacji aktywności chymozyny nad plazminą [24]. Elektroforeza żelowa przeprowadzona w pierwszym miesiącu dojrzewania wykazała szybki rozkład αs1-kazeiny przez chymozynę do pierwotnego produktu degradacji αs1-CN f24-199 oraz powstawanie γ-CN z β-CN, dzięki działaniu plazminy. W porównaniu z komercyjnymi koagulantami, tradycyjnie wytwarzana jagnięca podpuszczka powoduje intensywniejszą proteolizę, co obserwowano m.in. w serach Pecorino Romano. W serze Fossa całkowita degradacja αs1-CN następuje po sześciu miesiącach dojrzewania, podczas gdy znaczna część β-CN pozostaje niezhydrolizowana. Analiza chromatograficzna (RP-FPLC) frakcji azotu rozpuszczalnego w wodzie ujawniła bardziej złożony profil peptydowy w serach z mleka surowego, co można powiązać z intensywniejszą proteolizą [6].

Hydroliza kazeiny prowadzi do zwiększenia udziału azotu rozpuszczalnego w wodzie, który jest jednym z kluczowych wskaźników dojrzewania sera. Na przykład, pod koniec dojrzewania Parmigiano Reggiano zawartość tego azotu osiąga około 34% całkowitej zawartości azotu, podczas gdy we Fiore Sardo wynosi około 25,5% [15]. Warto jednak zaznaczyć, że przebieg proteolizy w takich serach może różnić się w zależności od regionu produkcji oraz źródła użytej jagnięcej pasty podpuszczkowej. Aby zachować powtarzalność tradycyjnych cech serów, zaleca się stosowanie ustandaryzowanej jagnięcej pasty podpuszczkowej, uzyskanej poprzez jednolite żywienie jagniąt i kontrolowane warunki ich uboju [6].

Stężenie niskocząsteczkowych peptydów i wolnych aminokwasów wywiera istotny wpływ na smak sera [23], a ich szybka akumulacja zachodzi głównie w późniejszych etapach dojrzewania [13]. Włoskie sery twarde, takie jak m.in. Parmigiano Reggiano, charakteryzują się wysoką zawartością FAA, co pozwala próbować szacowania wieku sera za pomocą modeli chemometrycznych opartych na stężeniach markerów, m.in. seryny, kwasu glutaminowego, argininy i ornityny. Wydaje się, że spośród wielu przemian biochemicznych to właśnie katabolizm FAA w największym stopniu warunkuje finalny smak sera. Złożone reakcje, takie jak dekarboksylacja, deaminacja, transaminacja, desulfuracja czy rozszczepienie łańcuchów bocznych, przekształcają FAA w związki zapachowe – aldehydy, alkohole i kwasy – które wraz z produktami lipolizy i katabolizmu kwasów tłuszczowych kształtują lotny profil aromatyczny serów twardych [6, 20]. W trakcie dojrzewania obserwuje się także degradację niektórych pojedynczych aminokwasów, takich jak kwas glutaminowy czy tyrozyna. Na późniejszych etapach dojrzewania spadek kwasu glutaminowego towarzyszy wzrostowi zawartości kwasu γ-aminomasłowego (GABA). W przypadku sera Fiore Sardo charakterystyczny dla późnych etapów dojrzewania jest równoczesny spadek kwasu glutaminowego i wzrost stężenia GABA, co wynika z aktywności niektórych mezofilowych pałeczek kwasu mlekowego zdolnych do dekarboksylacji glutaminianu do GABA [15]. Jeszcze niedawno obecność GABA w serach uznawano za oznakę nieprawidłowego przebiegu fermentacji, prowadzącą do wad organoleptycznych. Obecnie, ze względu na poznane funkcje fizjologiczne GABA – m.in. działanie neurotransmiterowe, obniżające ciśnienie krwi, moczopędne i uspokajające – sery zawierające ten związek mogą być uznawane za żywność funkcjonalną [2]. Warto jednak pamiętać, że nawet w przypadku tego samego typu tradycyjnego sera rzemieślniczego z surowego mleka owczego mogą występować znaczące różnice w profilach sensorycznych, zależne od technologii produkcji, rodzaju szczepów autochtonicznych, pory roku i czasu dojrzewania [9].

W trakcie dojrzewania sera Fiore Sardo obserwuje się systematyczny wzrost udziału azotu rozpuszczalnego w wodzie (WSN) w stosunku do azotu całkowitego (TN) [24]. Wynika on z aktywności proteolitycznej mikroflory sera oraz proteaz zawartych w podpuszczce, które uczestniczą w hydrolizie kazeiny. Podczas tradycyjnego dojrzewania tego sera stwierdzono istotny przyrost zarówno WSN, jak i azotu niebiałkowego (NPN), przy czym współczynnik dojrzewania (WSN/TN × 100) po 7 miesiącach osiągnął średnio 24% (tab. 3) [9].

Tabela 3. Zmiany frakcji azotowych w serze Fiore Sardo podczas dojrzewania

Wyjaśnienie skrótów:
TN – azot ogółem (ang. total nitrogen);
WSN – azot rozpuszczalny w wodzie (ang. water soluble nitrogen);
NPN – azot niebiałkowy (ang. non-protein nitrogen)
źródło: [9]

Podwyższone wartości współczynnika indeksu dojrzewania mogą wynikać z aktywności proteolitycznej rodzimych mezofilowych pałeczek kwasu mlekowego, w tym przede wszystkim Lb. plantarum, która preferencyjnie rozkłada β-kazeinę i może odpowiadać za „przyspieszone” dojrzewanie sera. Ogólnie, wysoki poziom azotu niebiałkowego (NPN) w dojrzałym Fiore Sardo świadczy o intensywnej aktywności mikroflory mlekowej, natomiast wzrost indeksu dojrzewania w czasie, odzwierciedla stopniowe powstawanie różnorodnych związków azotowych w wyniku proteolizy. Proces ten przebiega etapami: początkowo tworzą się polipeptydy, następnie peptydy o niskiej i średniej masie cząsteczkowej, a w końcowej fazie – wolne aminokwasy. Pod koniec dojrzewania całkowita zawartość FAA w serze Fiore Sardo może osiągać około 1000 mg na 100 g produktu [9].

Profil aminokwasowy Fiore Sardo jest zbliżony do innych tradycyjnych serów owczych. Przez cały okres dojrzewania największe stężenia odnotowuje się dla kwasu glutaminowego, leucyny, waliny i lizyny – aminokwasów dominujących w długo dojrzewających serach twardych i półtwardych, w których główną mikroflorę stanowią bakterie z rodzajów Lactococcus i Lactobacillus, co potwierdzono w innych serach surowego mleka owczego [5, 13, 14, 16]. Obecność tych aminokwasów w najbardziej dojrzałych serach wskazuje na prawidłowy przebieg proteolizy, kluczowego procesu kształtującego teksturę, smak i aromat produktu [2]. W znaczących ilościach obecna jest także prolina, nadająca serowi słodki smak [13], której zawartość rośnie wraz z dojrzewaniem, podobnie jak tyrozyny, cysteiny, treoniny i seryny. Zwiększenie zawartości proliny podczas dojrzewania może być efektem intensywnej hydrolizy β-kazeiny, polipeptydu bogatego w ten aminokwas. Z kolei wzrost kwasu glutaminowego i lizyny do około 90. dnia, a następnie ich wyraźny spadek, można powiązać z wysoką liczebnością bakterii kwasu mlekowego do tego momentu. Świadczy to o roli tych mikroorganizmów w kształtowaniu smaku i aromatu sera poprzez przekształcanie wolnych aminokwasów w związki lotne. Aminokwasy uwalniane z peptydów są dalej metabolizowane przez enzymy obecne w serze do kwasów, aldehydów i amin, które odpowiadają za rozwój charakterystycznego smaku Fiore Sardo [9].

Aminy biogenne
Problem zdrowotny związany jest z obecnością amin biogennych w serach twardych, zwłaszcza w serze Pecorino. Do głównych czynników ryzyka należą intensywna aktywność fermentacyjna naturalnych, autochtonicznych mikroorganizmów, długi okres dojrzewania (ponad 3,5 miesiąca), temperatura dojrzewania [5] oraz brak obróbki termicznej mleka [25].

Dekarboksylazy pochodzące od NSLAB w trakcie długiego dojrzewania mogą powodować powstawanie amin biogennych w ilościach potencjalnie szkodliwych, szczególnie tyraminy – najczęściej występującej aminy biogennej w serach, zwłaszcza z mleka surowego. Tyramina może wywoływać tzw. „reakcję serową”, objawiającą się m.in. wzrostem ciśnienia krwi, silnymi bólami głowy, kryzysem nadciśnieniowym czy niewydolnością serca [5]. Literatura podaje, że zawartość amin biogennych w serach może być bardzo zmienna – od 100 do 5000 mg/kg – w zależności od wielu czynników, takich jak higiena środowiska produkcyjnego, pasteryzacja mleka, rodzaj kultur starterowych, pH sera, zawartość soli i wody oraz czas i temperatura dojrzewania [20]. W próbkach sera Fiore Sardo całkowita zawartość amin biogennych oznaczona metodą HPLC-FL wynosiła średnio 127 ± 87 mg/100 g, mieszcząc się w zakresie 6-366 mg/100 g. Najwyższe stężenia dotyczyły tyraminy (82 ± 51 mg/100 g) oraz putrescyny (21 ± 26 mg/100 g) [5]. Inne badania wskazują tyraminę (350 mg/kg), putrescynę (150 mg/kg), histaminę (80 mg/kg) i kadawerynę (30 mg/kg) jako dominujące aminy biogenne [9].

Znaczną zmienność zawartości amin biogennych między serami, a nawet w obrębie tego samego gospodarstwa, przypisuje się różnicom w technikach przygotowywania i stosowania pasty podpuszczkowej. Ogólnie, całkowita zawartość amin biogennych w Fiore Sardo jest stosunkowo niska w porównaniu z innymi serami owczymi. Oprócz temperatury, pH i dostępności wolnych aminokwasów, kluczową rolę w produkcji amin biogennych odgrywają mikroorganizmy posiadające aktywność dekarboksylazy aminokwasów, przede wszystkim z rodzaju Lactobacillus [26].

Lipoliza podczas dojrzewania sera Fiore Sardo
Lipoliza stanowi jedną z kluczowych przemian biochemicznych zachodzących w trakcie dojrzewania sera. Proces ten prowadzi do uwalniania wolnych kwasów tłuszczowych (WKT), zwłaszcza krótkołańcuchowych, które w sposób bezpośredni wpływają na smak i aromat sera. Pośrednio natomiast WKT stanowią substrat do powstawania licznych związków odpowiedzialnych za walory sensoryczne, takich jak metyloketony, alkany, laktony czy estry. Do głównych źródeł aktywności lipolitycznej w serze należą enzymy: (1) pochodzące naturalnie z mleka (lipazy mleczne), (2) zawarte w podpuszczce – zarówno przedżołądkowe, jak i żołądkowe, oraz (3) syntetyzowane przez bakterie obecne w serze. W większości serów dojrzewanie przebiega przy minimalnym udziale lipolizy. W przypadku włoskich serów twardych, takich jak Fiore Sardo, proces ten jest jednak znacznie bardziej intensywny. Lipidy pełnią istotną rolę w kształtowaniu smaku sera, będąc źródłem WKT, które następnie ulegają dalszej przemianie w związki odpowiadające za aromat, np. metyloketony, a także mogą działać jako rozpuszczalnik dla innych związków smakowych powstających zarówno z lipidów, jak i innych prekursorów [9].

Tradycyjne pasty podpuszczkowe, wytwarzane z żołądków młodych jagniąt nieodsadzonych od matki i ubijanych z pełnym żołądkiem, charakteryzują się wysoką aktywnością lipolityczną dzięki obecności PGL wydzielanej podczas ssania mleka. Zmiana diety jagniąt z mleka na paszę roślinną oraz brak pokarmu w żołądku podczas uboju zmniejsza zawartość PGL w żołądku i w paście podpuszczkowej, tak jak ma to miejsce w podpuszczce produkowanej przemysłowo. Lipaza przedżołądkowa wykazuje specyficzność wobec krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych w pozycji sn-3 triacylogliceroli, co prowadzi do uwalniania dużych ilości kwasu masłowego (C4:0), nadającego Fiore Sardo charakterystyczny ostry i pikantny smak. Sery wytwarzane z jagnięcej pasty podpuszczkowej (np. Idiazabal) zawierają znacznie więcej WKT niż sery z podpuszczki cielęcej. W serach z jagnięcej pasty ponad 65% wszystkich WKT stanowią kwasy krótkołańcuchowe, podczas gdy w serach z podpuszczki cielęcej tylko 45%. Proporcja krótkołańcuchowych wolnych kwasów tłuszczowych SCFFAs (ang. Short-Chain Free Fatty Acids) w stosunku do całkowitych WKT powyżej 50 μmol/100 μmol może być używana jako marker użycia w produkcji tradycyjnej, rzemieślniczej podpuszczki [9].

Aktywność lipolityczna pasty zależy od sposobu jej przygotowania. Enzymy pochodzące z różnych tkanek (lipaza przedżołądkowa, żołądkowa, esterazy) tworzą jej układ lipolityczny [24]. U młodych jagniąt lipaza przedżołądkowa, wydzielana podczas ssania mleka i transportowana do żołądka wraz z pobranym pokarmem, wspomaga trawienie tłuszczu, którego trzustka nie jest jeszcze w stanie efektywnie rozłożyć [6]. Hydroliza tłuszczu mlekowego przez te enzymy prowadzi do powstania wolnych kwasów tłuszczowych, które nadają serom pikantny aromat [24]. Specyfika i aktywność lipolityczna enzymów w paście zależą od wieku, diety i stanu fizjologicznego jagniąt. Dieta mleczna stymuluje wydzielanie lipaz przedżołądkowych, uwalniających głównie krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe. Natomiast przejście jagniąt z diety mlecznej na paszę zielną oraz brak pokarmu w żołądku w chwili uboju, zwiększają udział esteraz żołądkowych, które stanowią wówczas niemal połowę wszystkich enzymów lipolitycznych w podpuszczce. Enzymy te, wydzielane przez gruczoły śluzowe żołądka, wykazują preferencyjną aktywność wobec mono- i diglicerydów, najczęściej hydrolizując kwasy tłuszczowe o średnich i długich łańcuchach [24].

Enzymy odpowiedzialne za lipolizę w serze, przede wszystkim lipazy i esterazy, pochodzą z różnych źródeł: mleka surowego (rodzima lipaza lipoproteinowa nieulegająca inaktywacji podczas pasteryzacji), pasty podpuszczkowej, pierwotnych i wtórnych kultur starterowych, NSLAB oraz zewnętrznych preparatów lipaz. Należy jednak zauważyć, że poza pleśniami aktywność lipolityczna mikroorganizmów obecnych w serze jest zwykle znacznie niższa niż aktywność innych źródeł enzymów [15]. Co istotne, w porównaniu z procesem proteolizy, lipoliza przebiega szybciej w partiach zewnętrznych sera [6].

Cechy sensoryczne sera Fiore Sardo
Smak, aromat i konsystencja sera kształtują się w wyniku licznych reakcji chemicznych, enzymatycznych i mikrobiologicznych zachodzących podczas dojrzewania. W tradycyjnych serach rzemieślniczych tego samego typu często obserwuje się duże różnice w zależności od stosowanych praktyk serowarskich, pory roku produkcji, czasu dojrzewania, składu wtórnej mikroflory oraz wielkości produkcji [20, 27].
Wolne kwasy tłuszczowe, uwalniane w procesie lipolizy, wraz z lotnymi związkami aromatycznymi i produktami proteolizy, mają bezpośredni wpływ na smak sera [9]. Lipoliza jest szczególnie istotna w serach z mleka surowego, ponieważ obecne w nim lipazy lipoproteinowe mleka oraz bakteryjne (od NSLAB) przyczyniają się do powstawania wolnych kwasów tłuszczowych [23].

Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, ze względu na swoje wysokie stężenie i niskie progi wyczuwalności, mają istotny wpływ na właściwości sensoryczne serów wytwarzanych z jagnięcej pasty podpuszczkowej. Szczególnie udział SCFFAs, a w tym znacząca zawartość kwasu masłowego, wykazuje bezpośrednią, liniową korelację z pożądaną w Fiore Sardo intensywnością pikantnego smaku i wyraźnym aromatem [22]. Intensywność lipolizy zależy od czasu dojrzewania sera, co tłumaczy różnice w profilu sensorycznym, nawet w obrębie tego samego rodzaju sera. Włoskie twarde sery zawierające egzogenną lipazę, taką jak przedżołądkowa esteraza (PGE, ang. Pregastric Esterase), wyróżniają się pod względem przebiegu lipolizy. Charakterystyczny i pożądany smak sera Fiore Sardo wynika z obecności PGE w paście podpuszczkowej, która oprócz koagulacji mleka, pełni również funkcję czynnika lipolitycznego w trakcie dojrzewania [6]. Całkowita zawartość wolnych kwasów tłuszczowych w innych twardych serach wytwarzanych bez użycia pasty podpuszczkowej, takich jak Parmigiano Reggiano, wynosi jedynie ok. 20% stężenia typowego dla serów typu pecorino, np. Fiore Sardo, produkowanych z dodatkiem pasty podpuszczkowej [14].

Aktywność lipolityczna, prowadząca do hydrolizy tłuszczów, odgrywa kluczową rolę w dojrzewaniu sera Fiore Sardo. Proces ten jest bardzo intensywny przez cały okres dojrzewania, co skutkuje znacznym nagromadzeniem wolnych kwasów tłuszczowych (WKT) w końcowym produkcie. Szczególnie ważne dla smaku są krótkołańcuchowe WKT, takie jak kwas masłowy, kwas propionowy, kwas heksanowy [28], oktanowy [15] czy dekanowy, które nadają serom, w tym Fiore Sardo, charakterystyczny, intensywny, ale zrównoważony, pikantny smak [16]. Szybkie uwalnianie kwasu masłowego wynika z preferencyjnej hydrolizy przez jagnięcą PGE kwasów tłuszczowych zestryfikowanych w pozycji sn-3 glicerolu, przy czym w tłuszczu mlekowym ok. 90% kwasu masłowego jest umiejscowione właśnie w tej pozycji. Intensywność smaku sera jest bezpośrednio powiązana z zawartością kwasu masłowego, jednak dla uzyskania pełnej, pożądanej smakowitości istotny jest także względny udział różnych wolnych kwasów tłuszczowych. Wyraźnie wyższa niż w innych sardyńskich serach owczych z ChNP zawartość WKT w Fiore Sardo może być częściowo związana z relatywnie wysoką zawartością tłuszczu, wynoszącą 5-6%, w mleku owiec rasy sarda. Kluczową rolę w tworzeniu WKT odgrywają jednak enzymy lipolityczne: (1) naturalnie występujące w mleku (lipazy konstytutywne), (2) pochodzenia bakteryjnego oraz (3) zawarte w paście podpuszczkowej używanej przy produkcji sera, znanej z wysokiej aktywności lipaz. Po 210 dniach dojrzewania w Fiore Sardo dominującymi WKT są kwasy: palmitynowy, oleinowy, mirystynowy i masłowy. W trakcie dojrzewania obserwuje się również znaczący wzrost zawartości krótkołańcuchowych WKT, takich jak kwas masłowy, kaprynowy i kapronowy [6]. Wysoka zawartość kwasu masłowego w tym serze jest prawdopodobnie efektem specyficznej aktywności lipaz obecnych w jagnięcej paście podpuszczkowej [9]. Zauważalne wraz z postępem dojrzewania różnice w zawartości wolnych kwasów tłuszczowych w serach Fiore Sardo wiąże się przede wszystkim z aktywnością lipaz i esteraz pochodzących od autochtonicznych mikroorganizmów, w szczególności dominującego w populacji NSLAB Lactobacillus plantarum, których specyficzność substratowa jest porównywalna z pastą podpuszczkową i lipazą trzustkową [6]. Uwalnianie znacznych ilości kwasu linolowego pod koniec dojrzewania przypisuje się głównie rodzimym lipazom mleka oraz lipazom zawartym w podpuszczce, choć nie można wykluczyć udziału mezofilnych bakterii kwasu mlekowego o aktywności lipolitycznej. Specyficzne lipazy izolowane z Lactobacillus casei, występującego w Fiore Sardo, mogą dodatkowo przyczyniać się do akumulacji tego długołańcuchowego kwasu tłuszczowego w serze. Nie ulega wątpliwości, że hydroliza tłuszczu w trakcie dojrzewania, wraz z produktami lipolizy, znacząco wpływa na charakterystyczny smak i aromat sera [24].

Profil aromatyczny i związki lotne w serze Fiore Sardo
Charakterystyczna dla rzemieślniczego Fiore Sardo jest duża zmienność jego profilu aromatycznego, wynikająca zarówno z różnorodności rodzimej mikroflory surowego mleka, jak i specyficznych praktyk produkcyjnych lokalnych wytwórców [28]. Złożona struktura matrycy sera utrudnia ekstrakcję związków lotnych, co komplikuje identyfikację szlaków metabolicznych odpowiedzialnych za ich biosyntezę lub degradację [29]. Ze względu na bogactwo związków lotnych, Fiore Sardo można uznać za dominujący włoski ser owczy o intensywnej lipolizie podczas dojrzewania. Enzymy lipolityczne zawarte w podpuszczce efektywnie hydrolizują trójglicerydy tłuszczu mlekowego, prowadząc do uwalniania WKT. Zarówno same WKT, jak i produkty ich degradacji, nadają serowi wyraźne i zwykle bardzo intensywne właściwości sensoryczne [9].

Profil związków lotnych Fiore Sardo obejmuje głównie kwasy karboksylowe (ok. 68% całkowitej powierzchni pików SPME/GC-MS), następnie estry (14%), ketony i związki karbonylowe (9%) oraz alkohole (8%). Wśród krótkołańcuchowych liniowych kwasów karboksylowych dominuje kwas masłowy (60,78%), a następnie kwas heksanowy (31,64%) i oktanowy (2,62%), co jest w dużej mierze efektem działania przedżołądkowej lipazy, obecnej w paście podpuszczkowej. Ponad 30% całkowitej zawartości kwasów karboksylowych w serach stanowią kwasy: butanowy, heksanowy, oktanowy i dekanowy [14]. Dodatkowo wykryto śladowe ilości (łącznie ok. 1%) innych związków o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak fenole, pirazyny, związki siarkowe i furany [28]. Fiore Sardo wyróżnia się także relatywnie wysoką zawartością estrów, wśród których dominują estry etylowe. Najważniejszym z 15 estrów zidentyfikowanych w serze jest maślan etylu (ok. 55% tej klasy związków). Wyróżnia się on intensywnym aromatem niedojrzałych jabłek, nadającym serowi charakterystyczną owocową nutę, podobną do tej obecnej w serach Gruyère czy Parmigiano Reggiano [29]. Obecność estrów w serze wynika z estryfikacji WKT z alkoholami, zachodzącej zarówno w wyniku reakcji chemicznych, jak i enzymatycznych [28]. Wraz z estrami kwasów heksanowego (ok. 25%), oktanowego i dekanowego stanowią około 95% całkowitej zawartości estrów. Dla porównania, w 12-miesięcznym Grana Padano intensywność tego aromatu jest dziesięciokrotnie wyższa niż w świeżym mleku krowim. Estry etylowe uznawane są za kluczowe związki aromatyczne również w serach pleśniowych. Ze względu na niskie progi percepcji, wnoszą do serów pożądane nuty owocowe i kwiatowe. W niektórych przypadkach wykazano zależność między zawartością estrów a aktywnością enzymów produkowanych przez NSLAB [20].

Ketony stanowią także jedną z głównych grup lotnych związków w serze Fiore Sardo, podobnie jak w Pecorino Romano czy Parmigiano Reggiano, gdzie stanowią około 26% całkowitej powierzchni chromatograficznej nad próbką. W przypadku Fiore Sardo dominują metyloketony powstające z odpowiednich kwasów tłuszczowych (Cn+1) poprzez β-oksydację i późniejszą dekarboksylację. Najbardziej rozpowszechnione są 2-pentanon (52,17%), 2-heptanon (17,60%), 2-butanon (11,88%) oraz 2-propanon (8,72%). Charakterystyczne dla tych serów jest przeważanie metyloketonów o nieparzystej liczbie atomów węgla (C3-C9) nad tymi o liczbie parzystej (C4-C12). Jedna z hipotez wskazuje, że źródłem metyloketonów są wolne kwasy tłuszczowe uwalniane podczas lipolizy, które następnie ulegają katabolizmowi dzięki aktywności mikroorganizmów. W serze pokrewnym Fiore Sardo, Pecorino Sardo, stężenie metyloketonów wzrasta w trakcie dojrzewania [20, 28].

Alkohole (2‑pentanol, 1‑heksanol, 2‑heptanol i 1‑oktanol) są drugą, pod względem ilości, grupą lotnych związków w Fiore Sardo, stanowiąc około 23% całkowitej masy. Szybką redukcję aldehydów i ketonów do alkoholi pierwszo- i drugorzędowych wspierają silne warunki redukujące w serze [14]. Powstawanie alkoholi wynika z różnych szlaków metabolicznych – np. 2‑butanol, produkt redukcji acetoiny, wykazuje największą powierzchnię piku chromatograficznego (38,76%). Zauważono też wysoki poziom niezestryfikowanego etanolu (19,74%), co tłumaczy dominację estrów etylowych w obrębie ich klasy, gdyż etanol jest czynnikiem limitującym powstawanie innych estrów w serach twardych [28].

W trakcie dojrzewania sera Fiore Sardo obserwuje się degradację obecnej w niewielkich ilościach acetoiny przez enzymy bakterii NSLAB, co pozytywnie wpływa na cechy sensoryczne serów wytwarzanych z mleka surowego. Inne badania wskazują, że laktony stanowią drugą, co do wielkości grupę lotnych związków w Fiore Sardo, choć w serze Grana Padano ich udział wynosi zaledwie około 0,1% całkowitej zawartości neutralnych, lotnych substancji. Z kolei niski poziom aldehydów (np. jedynie 3‑metylobutanal [28]) świadczy o prawidłowym przebiegu dojrzewania, ponieważ aldehydy są szybko przekształcane w alkohole lub kwasy, co zapobiega gromadzeniu się niepożądanych nut smakowych [20]. Podczas dojrzewania pojawia się również znaczna ilość produktów rozkładu aminokwasów siarkowych, takich jak metionina i cysteina, prowadząc do powstawania związków siarkowych. Ich dalsze utlenianie generuje, m.in. metional oraz disulfid i trisulfid dimetylu, uznawane za kluczowe dla charakterystycznego aromatu serów typu cheddar, emmental, camembert czy Gruyère [14].

W Fiore Sardo wykryto także alkeny, których obecność wiąże się bardziej z dietą owiec niż z samym procesem dojrzewania sera [14]. Pomimo niskiego stężenia, związki śladowe, takie jak fenole i metoksyfenole, mają istotny wpływ na specyfikę aromatu ze względu na bardzo niski próg percepcji (1 ppb lub mniej). W Fiore Sardo stwierdzono relatywnie wysokie stężenia fenoli podstawionych grupami metylowymi i etylowymi, co jest typowe dla serów owczych. Fenole te powstają w wyniku mikrobiologicznego rozkładu aminokwasów aromatycznych (np. tyrozyna) lub z koniugatów powstających pod wpływem enzymów bądź na skutek procesu wędzenia [28]. Ponadto w Fiore Sardo wykryto terpeny, takie jak limonen i α‑pinen, które są charakterystyczne dla mleka owiec wypasanych na górskich pastwiskach i wynikają ze spożycia zielonej roślinności [29].

Podsumowanie
Proces dojrzewania sera Fiore Sardo stanowi złożony i wieloetapowy przykład interakcji mikrobiologiczno-biochemicznych, które determinują jego ostateczne cechy jakościowe. Profil mikrobiologiczny tego sera ulega dynamicznej ewolucji – sukcesja mikrobioty wpływa na intensywność i przebieg kluczowych przemian metabolicznych. Proteoliza i lipoliza, wspomagane przez aktywność mikroorganizmów, odpowiadają za uwalnianie wolnych aminokwasów i kwasów tłuszczowych, które są prekursorami licznych związków lotnych. Obecność amin biogennych wskazuje na znaczenie kontroli mikroflory w aspekcie bezpieczeństwa produktu. Efektem synergii tych procesów jest unikalny profil aromatyczny i sensoryczny sera Fiore Sardo, będący wypadkową zmian mikrobiologicznych, enzymatycznych oraz chemicznych. Studium tego ekosystemu dowodzi, że to właśnie synergiczne oddziaływanie tradycyjnych technik i rodzimej mikroflory warunkuje wyjątkowość produktu, którego właściwości są dziś analizowane przy użyciu zaawansowanych metod analitycznych.

dr inż. Bogdan Dec
Katedra Mleczarstwa i Zarządzania Jakością
Wydział Nauki o Żywności
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie

***

Czarnobiałe zdjęcia pochodzące ze strony internetowej www.visitgavoi.it/gastronomia/fiore-sardo-il-formaggio-dei-pastori/, autorstwa słoweńskiego fotografa – Žiga Koritnika, wykorzystano za zgodą Burmistrza i Przewodniczącego Rady Miasta Gavoi – Salvatore Lai.

Literatura

Coda R. i in., 2006, Comparison of the compositional, microbiological, biochemical, and volatile profile characteristics of nine Italian ewes' milk cheeses, Journal of Dairy Science, 89(11), s. 4126-4143.
Piras C. i in., 2013, A NMR metabolomics study of the ripening process of the Fiore Sardo cheese produced with autochthonous adjunct cultures, Food Chemistry, Volume 141, Issue 3, s. 2137-2147.
Licitra G., Carpino S., 2014, The Microfloras and Sensory Profiles of Selected Protected Designation of Origin Italian Cheeses, W: Donnelly C.W. (red.), Cheese and Microbes, ASM Press, s. 151-165.
Pisano M.B. i in., 2006, Microbiological and chemical characterization of Fiore Sardo, a traditional Sardinian cheese made from ewe's milk, International Journal of Dairy Technology, Vol. 9, Issue 3, s. 171-179.
Manca G. i in., 2020, Biogenic amines content in Fiore Sardo cheese in relation to free amino acids and physicochemical characteristics, Italian Journal of Food Safety, 9:8457.
Di Cagno R., Gobbetti M., 2011, Cheese: Hard Italian Cheeses, W: Fuquay J.W. (red.), Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition), Elsevier Ltd., s. 728-736.
Pisano M.B. i in., 2007, Characterization of Fiore Sardo cheese manufactured with the addition of autochthonous cultures, Journal of Dairy Research, 74, s. 255-261.
Anedda R. i in., 2021, Quality Control in Fiore Sardo PDO Cheese: Detection of Heat Treatment Application and Production Chain by MRI Relaxometry and Image Analysis, Dairy 2021, 2(2), 270-287.
Deiana P., Mangia N.P., 2012, Fiore Sardo Cheese, W: Hui Y.H. i Evranuz E.Ö. (red.), Handbook of Animal-Based Fermented Food and Beverage Technology, 2nd Edition, CRC Press, s. 387-396.
Mannu L. i in., 1999, Strain typing among enterococci isolated from home-made Pecorino Sardo cheese, FEMS Microbiology Letters, Vol. 170, Issue 1, s. 25-30.
Comunian R. in., 2010, Traditional and innovative production methods of Fiore Sardo cheese: a comparison of microflora with a PCR-culture technique, International Journal of Dairy Technology, Volume 63, Issue 2, s. 224-233.
Pisano M.B. i in., 2008, In vitro probiotic characteristics of lactobacillus strains isolated from Fiore Sardo cheese, Italian Journal of Food Science, Volume 20, Number 4, s. 505-516.
Madrau M.A. i in., 2006, Employment of autochthonous microflora in Pecorino Sardo cheese manufacturing and evolution of physicochemical parameters during ripening, International Dairy Journal, Volume 16, Issue 8, s. 876-885.
Di Cagno R. i in., 2003, Comparison of the microbiological, compositional, biochemical, volatile profile and sensory characteristics of three Italian PDO ewes’ milk cheeses, International Dairy Journal, Vol. 13, Issue 12, s. 961-972.
Gobbetti M. Hard Italian Cheese, 2016, Reference Module in Food Sciences, 1-15.
Medina M., Nuñez M. 2017, Cheeses From Ewe and Goat Milk, W: McSweeney P.L.H. i in. (red.), Cheese Chemistry, Physics and Microbiology (Fourth edition), Academic Press, s. 1069-1091.
Cosentino S. i in., 2001, Yeasts associated with Sardinian ewe's dairy products, International Journal of Food Microbiology, Volume 69, Issues 1-2, s. 53-58.
Fadda M.E. i in., 2004, Occurrence and characterization of yeasts isolated from artisanal Fiore Sardo cheese, International Journal of Food Microbiology, Volume 95, Issue 1, s. 51-59.
Mannu L. i in. 2000, Mesophilic lactobacilli in Fiore Sardo cheese: PCR-identification and evolution during cheese ripening, International Dairy Journal, Volume 10, Issues 5-6, s. 383-389.
Gobbetti M., R. Di Cagno, 2017, Extra-Hard Varieties, W: McSweeney P.L.H. i in. (red.), Cheese Chemistry, Physics and Microbiology (Fourth edition), Academic Press,, 809-828.
Mannu L. i in., 2002, A preliminary study of lactic acid bacteria in whey starter culture and industrial Pecorino Sardo ewes’ milk cheese: PCR-identification and evolution during ripening, International Dairy Journal, Volume 12, Issue 1, s. 17-26.
Addis M. i in., 2008, The use of lamb rennet paste in traditional sheep milk cheese production, Small Ruminant Research, Volume 79, Issue 1, s. 2-10.
Licitra G. i in., 2019, Artisanal Products Made With Raw Milk, W: Nero L.A. i De Carvalho A.F. (red.), Raw Milk: Balance Between Hazards and Benefits, Elsevier Inc., s. 175-221.
Pirisi A. i in., 2007, Relationship between the enzymatic composition of lamb rennet paste and proteolytic, lipolytic pattern and texture of PDO Fiore Sardo ovine cheese, International Dairy Journal, Volume 17, Issue 2, s. 143-156.
Zazzu C. i in., 2019, Biogenic Amines in Traditional Fiore Sardo PDO Sheep Cheese: Assessment, Validation and Application of an RP-HPLC-DAD-UV Method, Separations, 6(1), 11.
Manca G. i in., 2015, Comparison of γ-Aminobutyric Acid and Biogenic Amine Content of Different types of Ewe’s Milk Cheese Produced in Sardinia, Italy, Italian Journal of Food Safety, Jun 24;4(2):4700.
Anedda R. i in., 2021, Effect of the manufacturing process on Fiore Sardo PDO cheese microstructure by multi-frequency NMR relaxometry, Food Research International, Volume 140, 110079.
Urgeghe P.P. i in., 2012, SPME/GC-MS Characterization of the Volatile Fraction of an Italian PDO Sheep Cheese to Prevalent Lypolitic Ripening: the Case of Fiore Sardo, Food Analytical Methods, Vol. 5, s. 723-730.
Larráyoz P. i in., 2001, Comparison of dynamic headspace and simultaneous distillation extraction techniques used for the analysis of the volatile components in three European PDO ewes’ milk cheeses, International Dairy Journal, Volume 11, Issues 11-12, s. 911-926.