Przegląd Mleczarski 2/2026 – Wyzwania technologiczne i metodologia separacji wybranych frakcji białkowych serwatki: α-laktoalbuminy, β-laktoglobuliny

Przegląd Mleczarski 2/2026 – Wyzwania technologiczne i metodologia separacji wybranych frakcji białkowych serwatki: α-laktoalbuminy, β-laktoglobuliny

Rozwój nowoczesnych technologii membranowych oraz chromatograficznych spowodował, że współczesny przemysł mleczarski zmienił sposób postrzegania serwatki. Historycznie traktowana jako uciążliwy odpad o wysokim biochemicznym zapotrzebowaniu na tlen (BZT), stanowiący problem dla serowni, serwatka stała się jednym z najcenniejszych surowców w sektorze spożywczym.


Ta zmiana perspektywy jest napędzana rosnącą świadomością na temat unikalnych właściwości odżywczych i funkcjonalnych białek serwatkowych, które stanowią ok. 20% całkowitej puli białek mleka krowiego [1]. Co istotne, w dobie rosnącego zapotrzebowania na żywność funkcjonalną, nutraceutyki oraz spersonalizowane żywienie medyczne, produkcja koncentratów białek serwatkowych (WPC) czy izolatów (WPI) przestaje być wystarczająca. Przemysł dostrzega coraz częściej potrzebę precyzyjnego frakcjonowania poszczególnych komponentów białkowych, aby w pełni wykorzystać ich specyficzny potencjał biologiczny [2]. Kluczowe znaczenie ma α-laktoalbumina (α-La), szczególnie w produkcji żywności dla niemowląt i żywności medycznej, ze względu na korzystny skład aminokwasowy i wysoką zawartość tryptofanu [3]. Dużym zainteresowaniem, pomimo właściwości alergennych, cieszy się również          β-laktoglobulina (β-Lg), która stanowi największy udział we frakcji serwatkowej. Białko to wykazuje doskonle właściwości emulgujące, pianotwórcze i żelujące, jak również stanowi doskonale źródło do otrzymywania bioaktywnych peptydów [4]. Glikomakropeptyd (nazywany również kazeinomakropeptydem, CMP) różni się od α-La i β-Lg swoim pochodzeniem. Nie jest on bowiem syntezowany jako oddzielne białko w komórkach gruczołu mlekowego, lecz powstaje w procesie koagulacji mleka pod wpływem podpuszczki. Jest to peptyd niezawierający fenyloalaniny, co powoduje, że jest stosowany w żywności przeznaczonej dla osób cierpiących na fenyloketonurię [5]. Pozostałe białka, takie jak laktoferyna i immunoglobuliny, choć występują w mniejszych ilościach, są bardzo istotne ze względu na ich działanie immunomodulujące i przeciwdrobnoustrojowe, przez co znajdują zastosowanie między innymi w produkcji nutraceutyków [6]. Separacja tych białek w skali przemysłowej, przy zachowaniu ich natywnej struktury i bioaktywności, stanowi jedno z największych wyzwań inżynierii procesowej żywności [7]. Trudność ta wynika z subtelnych różnic w ich właściwościach fizykochemicznych, skomplikowanej kinetyki denaturacji termicznej oraz tendencji do tworzenia kompleksów międzycząsteczkowych [8].
 
Charakterystyka biochemiczna i strukturalna wybranych białek serwatkowych
Zrozumienie molekularnych podstaw interakcji białek jest niezbędne do zaprojektowania skutecznych procesów separacji. Każde z wymienionych wyżej białek charakteryzuje się unikalnym zestawem cech – od masy cząsteczkowej, przez punkt izoelektryczny, aż po specyficzne domeny wiążące ligandy, które determinują ich zachowanie w procesach filtracyjnych, chromatograficznych i podczas obróbki termicznej.
                                               
α-Laktoalbumina
α-Laktoalbumina jest drugim, co do ilości, białkiem serwatkowym, stanowiącym ok. 13-20% całkowitej puli białek serwatkowych (stężenie w mleku ok. 1,0-1,5 g/l). Jest to białko o silnie konserwatywnej ewolucyjnie strukturze, wykazujące znaczną homologię sekwencyjną z lizozymem typu c. Podstawową, fizjologiczną rolą α-La w gruczole mlekowym jest udział w syntezie laktozy. Tworzy ona kompleks z enzymem galaktozylotransferazą, modyfikując jego specyficzność substratową tak, aby umożliwić przeniesienie galaktozy na glukozę, co prowadzi do powstania laktozy. Cząsteczka α-La jest małym, monomerycznym białkiem o masie cząsteczkowej 14 175 Da, zbudowanym ze 123 reszt aminokwasowych [2]. Jej zwarta, kulista struktura jest stabilizowana przez cztery mostki dwusiarczkowe (Cys6-Cys120, Cys28-Cys111, Cys61-Cys77, Cys73-Cys91), co nadaje jej relatywną odporność na proteolizę, ale jednocześnie determinuje jej sztywność strukturalną. Unikalną i technologicznie najważniejszą cechą α-La jest jej charakter metaloproteiny wiążącej wapń (Ca²⁺). Jon wapnia jest koordynowany w pętli wiążącej, tworząc strukturę typu               EF-hand, która jest kluczowa dla stabilizacji natywnej konformacji białka [9]. Wyróżnia się dwie główne formy α-La, których właściwości termiczne drastycznie się różnią:
  • Holo-α-L – forma nasycona wapniem. Jest to forma natywna, wysoce stabilna termicznie, z temperaturą denaturacji przekraczającą często 65-70°C w neutralnym pH.
  • Apo-α-La – forma pozbawiona wapnia. Usunięcie jonu Ca²⁺ (np. poprzez obniżenie pH poniżej 4,0 lub zastosowanie czynników chelatujących jak EDTA czy cytryniany) powoduje destabilizację struktury trzeciorzędowej. Apo-α-La przyjmuje konformację tzw. „stopionej globuli" (molten globule state), która charakteryzuje się zachowaną strukturą drugorzędową, ale zdezorganizowaną strukturą trzeciorzędową i luźniejszym upakowaniem łańcucha bocznego [10].
Różnica w stabilności termicznej między formą holo a apo jest fundamentem wielu metod separacji termicznej.        Apo-α-La denaturuje i agreguje w znacznie niższych temperaturach (często < 50°C) niż holo-α-La czy β-Lg, co pozwala na selektywne wytrącanie jednej z frakcji [11].
 
β-Laktoglobulina
β-Laktoglobulina jest głównym białkiem serwatkowym mleka krowiego, stanowiącym od 50% do nawet 58% całkowitej zawartości białek w serwatce. Jej stężenie w mleku krowim waha się w granicach 2-4 g/l, co czyni ją dominującym składnikiem, którego usunięcie lub izolacja jest często pierwszym krokiem w kaskadzie frakcjonowania. β-Lg jest typowym białkiem globularnym z rodziny lipokalin, co determinuje jej zdolność do wiązania małych cząsteczek hydrofobowych, takich jak retinol czy kwasy tłuszczowe. Monomer białka składa się ze 162 reszt aminokwasowych i posiada masę cząsteczkową wynoszącą ok. 18,3 kDa [2]. W populacji bydła mlecznego zidentyfikowano kilka wariantów genetycznych tego białka, przy czym najczęściej spotykane to warianty A i B [12]. Różnią się one zaledwie dwoma aminokwasami (w pozycjach 64 i 118), jednak te subtelne zmiany w sekwencji pierwszorzędowej mają istotny wpływ na właściwości funkcjonalne, takie jak stabilność termiczna, zdolność do żelowania oraz rozpuszczalność. Jedną z najbardziej charakterystycznych cech β-Lg jest jej zależna od pH równowaga asocjacyjna. W fizjologicznym pH mleka oraz w zakresie pH 5,2-7,0; białko to występuje głównie jako stabilny dimer o masie cząsteczkowej ok. 36 kDa. Ta dimeryczna struktura jest stabilizowana przez oddziaływania hydrofobowe oraz wiązania wodorowe między podjednostkami. Poniżej pH 3,5; w wyniku silnego odpychania elektrostatycznego, dimer dysocjuje do monomerów.      Z kolei w zakresie pH 3,5-5,2; a szczególnie w niskich temperaturach, dimery mogą asocjować, tworząc oktamery o masie bliskiej 146 kDa [13, 14]. To dynamiczne zachowanie ma kluczowe znaczenie dla procesów filtracji membranowej, gdzie efektywna wielkość cząsteczki (promień hydrodynamiczny) zmienia się w zależności od warunków środowiskowych, wpływając na jej retencję na membranach ultrafiltracyjnych [15]. Struktura trzeciorzędowa β-Lg jest stabilizowana przez dwa mostki dwusiarczkowe (Cys66-Cys160 oraz Cys106-Cys119), poza tym białko to zawiera jedną wolną grupę tiolową (-SH) zlokalizowaną przy reszcie cysteiny 121 (Cys121). Pod wpływem ogrzewania powyżej 65°C lub w warunkach wysokiego ciśnienia, następuje częściowe rozwinięcie struktury białka (przejście w stan stopionej globuli), co eksponuje reaktywną grupę -SH. Na skutek reakcji wymiany sulfhydrylowo-dwusiarczkowej, mogą wówczas tworzyć się agregaty zarówno z innymi cząsteczkami β-Lg, jak                      i z α-laktoalbuminą [16]. Proces ten jest istotny dla zrozumienia zjawiska foulingu membran oraz trudności w uzyskaniu czystych frakcji podczas obróbki termicznej.
 
Wyzwania technologiczne w procesach frakcjonowania α-laktoalbuminy i β-laktoglobuliny
Mimo niezaprzeczalnych korzyści wynikających z wykorzystania w produkcji żywności preparatów wzbogaconych w wybrane białka serwatkowe oraz postępu technologicznego, ich przemysłowa separacja napotyka ciągle na szereg barier technicznych. Serwatka jest układem wieloskładnikowym, białka w niej zawarte mają zbliżone masy cząsteczkowe (14,2 kDa dla α-La i 18,4 kDa dla β-Lg) i wykazują silną tendencję do interakcji, co utrudnia ich separację technikami membranowymi, bazującymi na różnicach w wielkości cząstek. Dlatego też projektowanie procesu separacji α-La i β-Lg opiera się głównie na różnicach w ich właściwościach fizykochemicznych, takich jak punkt izoelektryczny (pI) oraz hydrofobowość. W inżynierii procesowej kluczowym ograniczeniem jest ciągła konieczność wyboru między wysoką czystością otrzymywanej frakcji a wysokim odzyskiem, ponieważ poprawa jednego z tych parametrów zwykle odbywa się kosztem drugiego. Metody chromatograficzne oferują bardzo wysoką czystość            (> 95%), ale są kosztowne, ich użycie wiąże się między innymi z koniecznością stosowania dużych ilości chemikaliów, a także wody do regeneracji złóż. Metody membranowe i termiczne są tańsze i w pełni skalowalne, ale rzadko pozwalają na uzyskanie czystości powyżej 80-85% w jednym etapie [7]. Dlatego też osiągnięcie parametrów jakościowych charakterystycznych, np. dla środków spożywczych specjalnego przeznaczenia żywieniowego, wymaga najczęściej zastosowania złożonych instalacji obejmujących mikrofiltrację, ultrafiltrację, diafiltrację oraz chromatografię, co zdecydowanie podnosi koszty operacyjne (OPEX) i inwestycyjne (CAPEX). Aby sprostać opisanym wyzwaniom, naukowcy i inżynierowie opracowali szereg strategii, które można podzielić na trzy główne kategorie: metody fizykochemiczne, chromatograficzne i membranowe.
 
Selektywna precypitacja metodą termiczną
Metoda ta wykorzystuje różnice w stabilności termicznej białek w specyficznych warunkach pH i siły jonowej, i opiera się na odwracalnej lub nieodwracalnej selektywnej agregacji α-La lub β-Lg z dodatkowym etapem separacji zagregowanej frakcji za pomocą procesów wirowania lub mikrofiltracji. Pierwsza z metod, opisana przez Tolkacha i wsp., [17] polega na frakcjonowaniu białek serwatkowych poprzez selektywną agregację β-laktoglobuliny w warunkach podwyższonego pH (7,5), temperatury (97-102°C) oraz w obecności jonów wapnia (0,55 g/l) i laktozy (0,5 g/l). W tych warunkach β-Lg ulega kontrolowanej destabilizacji i tworzy agregaty (stopień denaturacji > 99%), podczas gdy α-laktoalbumina pozostaje w roztworze w formie natywnej (stopień denaturacji 24-26%, czystość na poziomie 98%). Przy czym stopień denaturacji obu białek jest zależny od temperatury, ich stężenia oraz czasu przetrzymania. Optymalne wyniki uzyskano w przypadku roztworu białek serwatkowych o stężeniu w zakresie 5-20 g/l. Istotnym ograniczeniem tej metody jest zatem konieczność prowadzenia procesu przy niskim stężeniu białka, co wymaga przetwarzania dużych objętości surowca i utrudnia jej ekonomiczne zastosowanie w produkcji α-La na skalę przemysłową.

Alternatywna strategia selektywnej precypitacji opiera się na konwersji stabilnej holo-α-La w wrażliwą na temperaturę i bardziej hydrofobową apo-α-La. Osiąga się to poprzez obniżenie pH do wartości bliskiej punktowi izoelektrycznemu α-La (pH 3,8-4,2) oraz – opcjonalnie – dodatek czynników chelatujących wapń (np. cytrynianów, EDTA) [18]. W tych warunkach β-Lg zachowuje stosunkowo wysoką stabilność oraz rozpuszczalność (głównie dzięki silnemu ładunkowi dodatniemu w niskim pH), natomiast apo-α-La ulega agregacji już przy łagodnym ogrzewaniu (temperatura 50-60°C, czas 20-150 minut). Wytrącony osad, wzbogacony w α-La, jest oddzielany przez wirowanie lub mikrofiltrację. Supernatant stanowi natomiast frakcję wzbogaconą w β-Lg i GMP. W tym przypadku głównym problemem jest odwracalność procesu. Agregaty α-La muszą zostać ponownie rozpuszczone (resolubilizacja) w neutralnym pH przy udziale jonów wapnia. Badania pokazują, że choć rozpuszczalność można przywrócić, odzyskanie pełnej natywnej struktury trzeciorzędowej jest trudne, a część białka może pozostać w formie trwale zdenaturowanej [11]. Ponadto, przy wyższych temperaturach dochodzi do koprecypitacji β-Lg, co obniża czystość frakcji α-La [19]. Zastosowanie selektywnej precypitacji umożliwia uzyskanie produktów wzbogaconych w α-La, zbliżonych pod względem składu do obecnych na rynku preparatów takich jak Hilmar™ 8800 firmy Hilmar Ingredients (30% α-La) oraz Lacprodan® Alpha-10 firmy Arla Foods Ingredients (41% α-La).

Separacja za pomocą technik chromatograficznych
Separacja α-La z serwatki z wykorzystaniem technik chromatograficznych, a w szczególności wymiany jonowej (IEX), należy obecnie do najczęściej stosowanych strategii frakcjonowania białek serwatkowych. Proces ten wykorzystuje różnice w punktach izoelektrycznych, gęstości ładunku powierzchniowego oraz powinowactwie poszczególnych białek do grup funkcyjnych żywic jonowymiennych, umożliwiając selektywne wiązanie, a następnie kontrolowaną elucję α-La i β-Lg. W pierwszym etapie procesu surowa serwatka lub koncentrat białek serwatkowych jest poddawany klarowaniu (mikrofiltracja), a następnie doprowadzany jest do warunków pH sprzyjających adsorpcji docelowych białek na danej żywicy jonowymiennej. W pracy Doultani i wsp. [20] zastosowano silnie kwaśny kationit (SP Sepharose Big Beads), na którym przy pH ok. 4,0 wiązały się wszystkie dodatnio naładowane białka serwatki, podczas gdy glikomakropeptyd i azot niebiałkowy przechodziły przez kolumnę niezwiązane. Po etapie wiązania i płukania następowała selektywna elucja poprzez sekwencyjną zmianę pH i składu buforów, bez konieczności stosowania wysokich stężeń soli w pierwszym etapie procesu. W tym przypadku kluczowa była optymalizacja wartości pH buforu, tak aby α-La o niższym punkcie izoelektrycznym niż β-Lg traciła powinowactwo do złoża wcześniej niż pozostałe białka serwatkowe. Pozwalało to na uzyskanie frakcji zawierającej praktycznie czystą α-La (odzysk rzędu 90-96%), a następnie frakcji WPI zubożonej w α-La, bogatej w β-Lg, IgG i BSA. Istotną zaletą rozwiązania była możliwość prowadzenia procesu przy wysokich prędkościach liniowych i z użyciem buforów dopuszczonych do zastosowań spożywczych, co tym samym zwiększa jego atrakcyjność przemysłową.

Mechanizm selektywnej separacji α-La i β-Lg na złożach jonowymiennych wynika z niewielkich, lecz wystarczających różnic w ich ładunku netto w zakresie pH 4-6. α-La (pI ≈ 4,2-4,5) traci dodatni ładunek szybciej wraz ze wzrostem pH niż β-Lg (pI ≈ 5,2-5,4), co umożliwia jej wcześniejsze wymywanie z kationitu lub w przypadku anionitów – późniejsze wiązanie. W praktyce przemysłowej szeroko stosuje się zarówno układy kationowymienne (wiązanie przy niskim pH, elucja przy skokowej zmianie pH), jak i anionowymienne (wiązanie powyżej pI, elucja gradientem soli). Jonowymienna chromatografia kolumnowa pozostaje metodą referencyjną do uzyskiwania wysokooczyszczonych frakcji α-La i β-Lg, zwłaszcza gdy wymagana jest nienaruszona struktura natywna obu wspomnianych białek. Alternatywnie można także stosować żywice anionowymienne, w których frakcjonowanie prowadzi się zwykle w pobliżu pH 6,0-6,5; a elucję realizuje się w gradiencie NaCl. Santos i wsp. [21] wykazali, że na silnym anionicie (Mono Q) możliwe jest jednoczesne wydzielenie frakcji zawierającej α-La (wraz z immunoglobulinami), osobnej frakcji BSA oraz dwóch wyraźnie rozdzielonych frakcji β-Lg odpowiadających wariantom A i B. W doświadczeniach tych α-La wymywano z kolumny przy niższej sile jonowej niż β-Lg, co potwierdza większą gęstość ładunku ujemnego β-Lg w tych warunkach. Praca ta pokazuje, że IEX pozwala nie tylko na rozdział α-La i β-Lg, lecz także na frakcjonowanie wariantów β-Lg, co ma znaczenie przy projektowaniu składników funkcjonalnych. Nie udało się natomiast rozdzielić od siebie α-La oraz IgG. Należy w tym miejscu zwrócić uwagę na fakt, iż opisywana w pracy Santos i wsp. [21] żywica Mono Q charakteryzuje się niewielką średnicą ziarna wynoszącą ok. 10 µm. W przypadku procesów wielkoskalowych dobór średnicy ziaren żywicy jonowymiennej jest istotnym aspektem projektowania procesu. Zmniejszenie rozmiaru cząstek zwiększa powierzchnię właściwą i poprawia zdecydowanie rozdzielczość, co jest korzystne na etapie badań laboratoryjnych i optymalizacji. Jednocześnie jednak mała średnica ziaren jest przyczyną wzrostu różnicy ciśnienia na kolumnie, ograniczając możliwą do zastosowania liniową prędkość przepływu i zwiększając tym samym koszty energetyczne oraz wymagania konstrukcyjne aparatury. Santos i wsp. zwracają uwagę, że żywice o średnicy rzędu 10 µm, choć zapewniają bardzo dobrą separację, mogą być problematyczne przy skalowaniu, ze względu na wysokie opory hydrauliczne; w praktyce przemysłowej preferuje się więc większe ziarna (np. 100-300 µm), które umożliwiają pracę przy wyższych przepływach i niższym ciśnieniu, kosztem niestety zdecydowanego pogorszenia rozdzielczości separacji. Podobnie w pracy Doultani i wsp. [20] zastosowanie żywicy Big Beads było swego rodzaju kompromisem między pojemnością wiązania a możliwością prowadzenia procesu przy wysokim objętościowym natężeniu przepływu. Warto zauważyć także, że zwiększenie liniowej szybkości przepływu przez kolumnę skraca czas kontaktu separowanych białek ze złożem, co w rezultacie może niekorzystnie wpłynąć na wydajność wiązania. Z drugiej strony przy zbyt niskiej szybkości liniowej etap wiązania trwa zbyt długo, co może skutkować niekontrolowanym wzrostem mikroorganizmów w układzie separacyjnym i tym samym przyczynić się do spadku jakości uzyskiwanego produktu.

Innym ważnym aspektem stosowania żywic w praktyce przemysłowej jest ocena ich zdolności do wiązania białek. Parametr ten jest krytyczny, pozwala określić, ile żywicy potrzeba do separacji określonej ilości białka. Porównanie deklarowanej przez producentów pojemności badanych żywic nie zawsze jest jednak takie proste. Może zaistnieć konieczność zastosowania różnych metod oraz warunków procesu. Aby móc porównać specyfikacje różnych dostawców, niezbędne jest posiadanie informacji na temat warunków stosowanych do określenia pojemności żywicy. Niestety w wielu przypadkach nie jest podana zastosowana metodyka badania pojemności żywic, często wręcz nie ma tych danych w specyfikacji. Dostawcy, by uniknąć problemów i ewentualnych roszczeń, podają bardzo szeroki zakres pojemności i podkreślają, że ostateczny wynik jest zależny od bardzo wielu czynników. Jest to podejście do pewnego stopnia słuszne, w wielu przypadkach mamy do czynienia z relatywnie wysoką zmiennością surowca, różna jest także kultura pracy personelu obsługującego instalację. W takiej sytuacji może wystąpić niezależna od jakości żywicy zmienność w przebiegu procesu separacji. Porównując żywice pod kątem ich użyteczności w separacji danego białka należy zweryfikować pojemność na konkretnym układzie eksperymentalnym, możliwie zbliżonym do układu rzeczywistego. Kluczowe są warunki eksperymentu (pH, sól/jej przewodnictwo, rodzaj i stężenie białka/białek). Pojemność żywicy możemy ocenić metodą statyczną (SBC, zwaną także całkowitą pojemnością białka), którą wyznacza się zazwyczaj w trybie wsadowym. SBC jest zwykle podawana jako maksymalna ilość białka związanego z żywicą chromatograficzną w danych warunkach (dla danego rozpuszczalnika i stężenia białka). Natomiast dynamiczna zdolność wiązania (DBC) to zdolność wiązania wyznaczona w warunkach operacyjnych (tj. w kolumnie do chromatografii z wypełnieniem, na które nanosi się badaną próbkę w przepływie). DBC żywicy chromatograficznej to ilość docelowego białka, która wiąże się z żywicą w danych warunkach przepływu, zanim nastąpi znaczące przebicie złoża. Wyznaczając DBC konieczne jest ciągłe monitorowanie sygnału z detektora UV (najczęściej przy 280 nm). Białko zwiąże się z żywicą do osiągnięcia punktu przebicia, po przekroczeniu którego niezwiązane białko przepływa przez kolumnę (następuje wyrównanie stężeń w strumieniu napływającym i wypływającym z kolumny). Krzywą przebicia generuje się poprzez wykreślenie ilości załadowanego białka [mg] na jednostkę objętości żywicy [ml] w funkcji procentowego przebicia wyrażonego jako frakcja z C/Co (wykres 1).

Wykres 1. Przykładowa krzywa przebicia żywicy wraz z symulacją czasu trwania cyklu wiązania białka


DBC można określić na krzywej przebicia, przy założeniu, że strata może wynosić np. nie więcej niż 10% białka (określanej jako wartość C/Co = 0,1). Mając na uwadze warunki procesu można z całą pewnością stwierdzić, że dynamiczna zdolność wiązania (DBC), w sposób zdecydowanie bardziej wiarygodny opisuje właściwości żywicy. Dla typowych żywic jonowymiennych stosowanych do białek serwatkowych, pojemność dynamiczna wynosi zwykle kilkadziesiąt mg białka na ml złoża (30-80 mg/ml żywicy, zależnie od pH, siły jonowej, składu mieszaniny i prędkości przepływu) [22]. Wysoka zawartość białka w strumieniu zasilającym, przy relatywnie niskiej pojemności dostępnych żywic stanowi istotne wyzwanie dla chromatografii jonowymiennej (IEX) i jest niestety jednym z głównych ograniczeń dla szerszego zastosowania tej techniki w przemysłowym frakcjonowaniu białek serwatki (α-La i β-Lg). Przy strumieniach o wysokim sumarycznym stężeniu wiązanych białek (np. 5 g/l, wykres 1) złoże bardzo szybko ulega wysyceniu, co prowadzi do wczesnego „przebicia” białek do odpływu, spadku selektywności rozdziału, nasilenia zjawisk konkurencyjnej adsorpcji i wypierania oraz konieczności częstego zatrzymywania procesu w celu regeneracji złoża. W praktyce oznacza to, że im wyższe stężenie białka w nadawie, tym krótszy cykl pracy kolumny. Przy przetwarzaniu serwatki lub WPC o wysokiej zawartości białka, kolumna bardzo szybko osiąga granicę pojemności, co wymusza częste sekwencje: elucja → mycie → regeneracja → ponowne równoważenie. Te etapy nie tylko wydłużają całkowity czas cyklu, ale również generują znaczne zużycie wody, buforów, środków CIP (NaOH, kwasy) oraz powodują przerwy w produkcji, obniżając produktywność objętościową instalacji. Warto zaznaczyć, że przeładowanie kolumny jonowymiennej ma bezpośredni i silny wpływ na czystość otrzymywanego białka i jest jednym z głównych powodów pogorszenia selektywności rozdziału w IEX. Ponadto w rzeczywistych układach wielobiałkowych przeładowanie wzmacnia zjawiska konkurencyjnej adsorpcji i wypierania [23]. Silniej wiążące białka mogą wypierać słabsze z części złoża. W rezultacie część białek współwystępuje w tych samych strefach, co sprzyja ich wspólnemu wymywaniu w jednym piku. W badaniach nad frakcjonowaniem serwatki wykazano, że wysoka czystość α-La była osiągana tylko wtedy, gdy obciążenie kolumny utrzymywano znacznie poniżej maksymalnej pojemności wiązania, natomiast przy wzroście obciążenia β-Lg była obecna w frakcji α-La i odwrotnie [20, 21].
 
Zastosowanie technik membranowych
Separacja α-La i β-Lg metodami membranowymi wykorzystuje fakt, że białka te różnią się zarówno masą cząsteczkową, jak i właściwościami elektrostatycznymi. Monomeryczna forma α-La ma masę około 14 kDa, natomiast β-Lg w warunkach fizjologicznych występuje głównie w formie dimeru o masie około 36-37 kDa. Różnice te są jednak stosunkowo niewielkie, dlatego klasyczna ultrafiltracja prowadzona na standardowych membranach o MWCO 5-10 kDa nie umożliwia ich rozdzielenia, oba białka są zatrzymywane i proces prowadzi jedynie do ich koncentracji. Selektywna separacja α-La i β-Lg wymaga zastosowania albo membran o znacznie większych porach, albo membran modyfikowanych poprzez wprowadzenie grup funkcyjnych obdarzonych określonym ładunkiem powierzchniowym, co wprowadza dodatkowy mechanizm rozdziału oparty na oddziaływaniach elektrostatycznych.

W przypadku standardowych, nieładowanych membran polimerowych (PES, PVDF) mechanizm rozdziału opiera się wyłącznie na efekcie sitowym. Ponieważ różnica rozmiarów hydrodynamicznych α-La i β-Lg jest niewielka, skuteczna separacja jest możliwa tylko wtedy, gdy stosuje się membrany o nominalnym MWCO znacznie wyższym niż masa obu białek. Badania Marelli i wsp. wykazały, że membrany PVDF o MWCO 50-100 kDa lub PES o MWCO ok. 300 kDa umożliwiają preferencyjny transport α-La do permeatu przy jednoczesnym większym stopniu zatrzymania β-Lg. Proces poprzedzano mikrofiltracją w celu usunięcia tłuszczu i agregatów białkowych, co istotnie ograniczało fouling i poprawiało powtarzalność separacji. W optymalnych warunkach (PVDF 50 kDa, TMP ≈ 200 kPa, pH 6,3) uzyskano permeat o czystości α-La rzędu 0,6-0,63 oraz stosunku α-La : β-Lg > 1,4 [24]. Autorzy cytowanej pracy zauważyli także, że w przypadku tego rodzaju membran warstwa osadu białkowego staje się w istocie „dynamiczną membraną wtórną”, a rzeczywista selektywność wynika ze sprzężenia rozmiaru porów, polaryzacji stężeniowej i struktury placka formującego się na jej powierzchni w trakcie procesu. To właśnie ta warstwa wtórna ogranicza transport większych, zagregowanych β-Lg, umożliwiając istotnie większą transmisję α-La.

Trzecią grupę stanowią membrany z ładunkiem powierzchniowym (ang. charged ultrafiltration membranes), które łączą mechanizm sitowy z oddziaływaniami elektrostatycznymi. W tego typu membranach na powierzchni porów zakotwiczone są dodatnio lub ujemnie naładowane grupy funkcyjne. Dzięki temu możliwe jest uzyskanie podwyższonej selektywności wówczas, gdy różnice rozmiarów cząsteczek są niewystarczające do ich efektywnej separacji. W odniesieniu do układu α-La/β-Lg kluczowe znaczenie ma pH procesu względem punktów izoelektrycznych białek. Przy pH ok. 6-7 oba białka są naładowane ujemnie, jednak β-Lg posiada wyższy ładunek. Zastosowanie dodatnio naładowanych membran powoduje silniejsze oddziaływania β-Lg z powierzchnią membrany, co prowadzi do jego preferencyjnego zatrzymywania, podczas gdy α-La w większym stopniu przechodzi do permeatu. W przypadku pH 4,3-4,4 ładunek wypadkowy α-La jest bliski zeru, wówczas białko to preferencyjnie przechodzi do permeatu, podczas gdy dodatnio naładowana β-Lg ulega koncentracji w strumieniu retentatu. Przy zastosowaniu pojedynczej, naładowanej dodatnio membrany ultrafiltracyjnej o MWCO 300 kDa, przy pięciokrotnej koncentracji, uzyskano strumień permeatu, który zawierał 82% α-La oraz retentatu zawierającego 12% α-La w przeliczeniu na suchą masę białka.

Rysunek 1. Schemat systemu wielostopniowego systemu membranowego
 
F – nadawa,
FM – nadawa po połączeniu strumieni z recyklingu,
P1, P2, P3 – strumienie permeatu,
R1, R2, R3 – strumienie retentatu

Wykazano ponadto, że zastosowanie wielostopniowego układu membran obdarzonych ładunkiem, przedstawionego schematycznie na rys. 1, umożliwia uzyskanie strumienia permeatu wzbogaconego w α-La o czystości 87% oraz retentatu bogatego w β-Lg o czystości wynoszącej 83% [25].
 
Podsumowanie
Analiza dostępnych rozwiązań technologicznych jednoznacznie wskazuje, że mimo znacznego postępu w rozwoju metod membranowych i chromatograficznych, efektywna i ekonomicznie uzasadniona separacja poszczególnych frakcji białkowych wciąż pozostaje istotnym wyzwaniem procesowym. Trudności te wynikają przede wszystkim z niewielkich różnic w masach cząsteczkowych i właściwościach hydrodynamicznych białek serwatkowych, ich zdolności do asocjacji i agregacji oraz wysokiej wrażliwości na zmiany pH, temperatury i składu jonowego środowiska.

Metody fizykochemiczne, oparte na selektywnej denaturacji lub agregacji β-laktoglobuliny, pozwalają na uzyskanie bardzo wysokiej czystości α-laktoalbuminy, jednak wymagają prowadzenia procesu przy niskich stężeniach białka, co istotnie ogranicza ich zastosowanie w skali przemysłowej. Z kolei chromatografia jonowymienna charakteryzuje się wysoką selektywnością i możliwością uzyskania frakcji o wysokiej jakości, lecz jej praktyczne zastosowanie ograniczają relatywnie niskie dynamiczne pojemności żywic oraz konieczność częstej regeneracji kolumn, co przekłada się na wysokie koszty operacyjne i zużycie mediów procesowych. Technologie membranowe oferują znacznie lepszą skalowalność i prostszą integrację z istniejącymi liniami produkcyjnymi, jednak ich selektywność w rozdziale α-laktoalbuminy i β-laktoglobuliny jest wciąż niewystarczająca do uzyskania wysokiej czystości w pojedynczym etapie, a dodatkowym ograniczeniem pozostaje fouling membran.

W świetle przedstawionych danych zasadne wydaje się dalsze rozwijanie technologii hybrydowych, łączących procesy membranowe lub precypitację termiczną z chromatografią. Wymienione metody wstępnej obróbki surowca pozwoliłyby na zmniejszenie obciążenia kolumn i tym samym poprawę ich produktywności objętościowej. Jednocześnie istotnym kierunkiem przyszłych badań jest poszukiwanie nowych generacji żywic chromatograficznych o wyższej dynamicznej pojemności wiązania oraz lepszej selektywności wobec białek serwatkowych, co mogłoby istotnie ograniczyć częstotliwość regeneracji i poprawić ekonomikę procesu. Równolegle konieczny jest rozwój bardziej selektywnych membran, w tym membran o kontrolowanym ładunku powierzchniowym i zoptymalizowanej strukturze porów, które pozwalałyby na skuteczniejsze wykorzystanie oddziaływań elektrostatycznych, przy jednoczesnym ograniczeniu zjawiska foulingu. Dalsze prace badawcze powinny również koncentrować się na lepszym zrozumieniu wpływu warunków procesu na konformację białek serwatkowych, a także na wykorzystaniu zaawansowanych metod analitycznych i modelowania w projektowaniu operacji jednostkowych. Takie podejście może umożliwić opracowanie bardziej stabilnych, energooszczędnych i elastycznych technologii frakcjonowania serwatki, odpowiadających rosnącym wymaganiom rynku składników funkcjonalnych i żywności specjalistycznej.
 
dr hab. inż. Wojciech Białas, prof. UPP
Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności
Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
 
Literatura
 
  1. Pillai A.T., Morya S., Kasankala L.M. Emerging Trends in Bioavailability and Pharma-Nutraceutical Potential of Whey Bioactives. Journal of Nutrition and Metabolism 2024, 2024, s. 8455666.
  2. Madureira A.R., et al. Bovine whey proteins – Overview on their main biological properties. Food Research International 2007, 40(10), s. 1197-1211.
  3. Petersen H., et al. Adequacy and safety of α-lactalbumin-enriched low-protein infant formula: A randomized controlled trial. Nutrition 2020, 74, s. 110728.
  4. Zheng S., Love B.J. A meta-analysis of β-lactoglobulin aggregation kinetics comparing temperature, concentration, and chemistry as modulating influences. Journal of Food Engineering 2016, 188, s. 8-12.
  5. Ebrahimi A., et al. Glycomacropeptide: A comprehensive understanding of its major biological characteristics and purification methodologies. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 2024, 23(3), s. e13370.
  6. Wang N., et al. Gastrointestinal stability, antimicrobial retention, and gut microbiota modulation by bovine lactoferrin: An integrated in vitro and in vivo study. International Dairy Journal 2026, 173, s. 106456.
  7. Cheang B., Zydney A.L. Separation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin using membrane ultrafiltration. Biotechnology and Bioengineering 2003, 83(2), s. 201-209.
  8. Romo M., et al. Caprine and bovine cheese whey valorization: High-pressure processing for α-lactalbumin fractionation from whey concentrates. International Dairy Journal 2026, 175, s. 106553.
  9. Permyakov E.A. α-Lactalbumin, amazing calcium-binding protein. Biomolecules 2020, 10(9), s. 1234.
  10. Moulick A.G., Chakrabarti J. Conformational fluctuations in the molten globule state of α-lactalbumin. Physical Chemistry Chemical Physics 2022, 24(35), s. 21348-21357.
  11. Haller N., Maier I., Kulozik U. Molecular analytical assessment of thermally precipitated α-lactalbumin after resolubilization. Foods 2021, 10(9), s. 2231.
  12. Ganai N.A., et al. Novel polymorphisms in the bovine β-lactoglobulin gene and their effects on β-lactoglobulin protein concentration in milk. Animal Genetics 2009, 40(2), s. 127-133.
  13. Lee Y.R., Hong Y.H. Electrophoretic behaviors of α-lactalbumin and β-lactoglobulin mixtures caused by heat treatment. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences 2003, 16(7), s. 1041-1045.
  14. Gottschalk M., et al. Protein self-association in solution: The bovine β-lactoglobulin dimer and octamer. Protein Science 2003, 12(11), s. 2404-2411.
  15. Mazzei R., et al. High purity of α-lactalbumin from binary protein mixture by charged UF membrane far from the isoelectric point to limit fouling. Applied Sciences 2021, 11(19), s. 9167.
  16. Gezimati J., Creamer L.K., Singh H. Heat-induced interactions and gelation of mixtures of β-lactoglobulin and α-lactalbumin. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1997, 45(4), s. 1130-1136.
  17. Tolkach A., Steinle S., Kulozik U. Optimization of thermal pretreatment conditions for the separation of native α-lactalbumin from whey protein concentrates by means of selective denaturation of β-lactoglobulin. Journal of Food Science 2005, 70(9), s. E557-E566.
  18. Haller N., Kulozik U. Continuous centrifugal separation of selectively precipitated α-lactalbumin. International Dairy Journal 2020, 101, s. 104566.
  19. Toro-Sierra J., Tolkach A., Kulozik U. Fractionation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin from whey protein isolate using selective thermal aggregation, optimized membrane separation and resolubilization techniques at pilot plant scale. Food and Bioprocess Technology 2013, 6(4), s. 1032-1043.
  20. Doultani S., Turhan K.N., Etzel M.R. Fractionation of proteins from whey using cation exchange chromatography. Process Biochemistry 2004, 39(11), s. 1737-1743.
  21. Santos M.J., Teixeira J.A., Rodrigues L.R. Fractionation of the major whey proteins and isolation of β-lactoglobulin variants by anion exchange chromatography. Separation and Purification Technology 2012, 90, s. 133-139.
  22. Liang Y., et al. Simultaneous isolation of lactoferrin and lactoperoxidase from bovine colostrum by SPEC 70 SLS cation exchange resin. International Journal of Environmental Research and Public Health 2011, 8(9), s. 3764-3776.
  23. El-Sayed M.M.H., Chase H.A. Single- and two-component cation-exchange adsorption of the two major whey proteins. Journal of Chromatography A 2009, 1216(50), s. 8705-8711.
  24. Marella C., Muthukumarappan K., Metzger L.E. Evaluation of commercially available wide-pore ultrafiltration membranes for production of α-lactalbumin-enriched whey protein concentrate. Journal of Dairy Science 2011, 94(3), s. 1165-1175.
  25. Arunkumar A., Etzel M.R. Fractionation of α-lactalbumin and β-lactoglobulin from bovine milk serum using staged positively charged tangential flow ultrafiltration membranes. Journal of Membrane Science 2014, 454, s. 488-495.








 

Najnowsze Artykuły

Licznik odwiedzin

20 146 078


Współpraca